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染色质免疫共沉淀（ChIP）的注意事项
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想要做好ChIP实验，必须要控制好6个方面，包括培养基内活细胞数量、交联时间长短、消化后的片段大小、抗体的种类和特异性、常规实验操作技术等多种因素影响 。想要控制这些过程，最核心的就是全面设置对照组。下面逐个做说明。 01、活细胞数量 活细胞计数后，如果最终用于ChIP实验的细胞数量太高，将直接导致甲醛交联时间增加，间接导致细胞数量/微球菌核酸酶比例增大，这些均可造成裂解的DNA小片段过长（超过1000bp），实验处理过程中极易丢失这些片段，最终也会造成PCR检测困难或失败。最佳的DNA片段长度是150bp-300bp。相反，如果细胞数量太少，则导致细胞数量/微球菌核酸酶比例减小，最终得到的DNA片段极可能小于100bp。 总之，DNA-蛋白丰度直接决定了ChIP实验所需的细胞数量，没有固定的数量标准，这些都需要预实验充分摸索。 02、甲醛交联时间 1%终浓度的甲醛交联时间推荐5-6分钟。时间过久，会造成裂解的DNA小片段过长（超过1000bp）。时间太短，会导致交联不完全，实验过程中导致一部分的DNA-蛋白质复合物分离，最终分析的结果必然是不准确的。 03、设置对照组 ChIP实验内对照：染色质断裂后，须按一定比例留取部分染色质溶液，此Input DNA（断裂后的基因组DNA）作为ChIP实验的内对照。内对照不仅可以验证染色质断裂的效果。如果按照取样比例换算，还可以根据Input DNA中靶序列的含量和染色质沉淀中的靶序列含量，推算ChIP实验效率，所以Input内对照是必须要设置的。 阳性抗体对照：目的抗体沉淀DNA-蛋白复合物时，必须需设置阳性抗体对照组。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的、各物种之间比较保守的蛋白抗体，常用组蛋白抗体。 抗体阴性对照：目的抗体沉淀蛋白DNA复合物时，必须需设置阴性抗体对照组。阴性对照所使用的抗体可以选择目的蛋白抗体宿主的血清蛋白。 04、目标蛋白抗体 ChIP实验中与一般的抗原-抗体免疫反应实验不太一样。 常规实验如western blot、蛋白质免疫共沉淀等，抗原上只要存在与抗体结合的位点，则二者的免疫反应基本不受到蛋白质空间结构影响。 ChIP实验中，染色质沉淀步骤时，蛋白和DNA处在交联状态，目标蛋白的结合位点形成空间阻碍，导致抗体无法与目标蛋白结合形成复合物。 因此，能力够做western blot、蛋白质免疫共沉淀实验的抗体不一定能够做ChIP实验，一定一定要使用已经过ChIP验证的抗体，否则实验必然失败。此外，抗体的浓度、孵育时间、孵育温度需要根据目标蛋白的丰度决定。目标蛋白丰度较低时，可能需要调整活细胞数量、过夜4℃孵育等。 05、常规实验操作 ChIP实验过程较长，过程繁琐，需要反复的洗柱、离心、吸液、换管、孵育、震荡。操作说起来很简单，但是每一步都需要小心操作，非常考验基本功，希望大家多多注意。 06、实验结果分析 对于Input DNA组，采用1.8%琼脂糖凝胶电泳，结果应该是片段集中于150bp到350bp之间，这样长度的DNA片段才是符合要求的。如下： 进一步，内对照组、阴性抗体对照组、阳性抗体对照组的纯化DNA先采用PCR扩增，随后通过1.8%琼脂糖凝胶电泳，得到的结果应该是这样的：空白对照组无条带、阴性抗体对照组条带弱或无、内对照组强条带、阳性对照组看到强条带。只有这样的结果才是成功的。后续才能进行RT-PCR实验。 |
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