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提高饲用抗菌肽稳定性的分子遗传设计策略
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摘 要：饲用抗菌肽具有特殊的物理破膜杀菌机制而不易产生耐药性，成为抗生素替代品的研发热点。但天然存在或是自主设计的抗菌肽均面临在体内环境稳定性低的问题，因此采用多种策略优化抗菌肽的相关特性对缓解上述问题具有重要意义。文章概述近年来通过分子遗传学手段提高抗菌肽盐离子和蛋白酶稳定性的各种策略，分析分子遗传手段在提高抗菌肽稳定性方面的优势和局限性，为今后抗菌肽的设计提供思路。 抗菌肽又称为宿主防御肽，是由生物有机体产生的前体经蛋白酶降解生成的具有生物学活性的小分子多肽。抗菌肽作为宿主用来对抗病原菌侵袭的第一道屏障，是许多生物体先天免疫系统的重要组成部分，可作为抗生素替代品在动物生产中应用[1-2]。抗菌肽发挥抗菌效果的作用方式为带正电的抗菌肽通过与致病菌中的负电荷成分产生静电作用，从而诱导形成两亲性结构，穿透和透化膜磷脂双分子层，造成菌膜去极化和内容物泄漏，最终导致细菌死亡[3]。抗菌肽这种独特的作用机制有助于防止细菌耐药性产生。抗菌肽还可以与细菌的内毒素直接结合，破坏内毒素聚集体，防止内毒素导致的炎症反应[4-5]。在饲粮中添加抗菌肽能够降低断奶仔猪的腹泻率，有效提高仔猪的生长性能和免疫力[6]。由于体内复杂的生理环境，天然和人工设计的抗菌肽均表现出受到抑制的抗菌活性。造成该现象的主要原因是体液中富含大量的盐类（一价和二价阳离子）、阴离子蛋白（人血白蛋白，HAS） 和蛋白酶等物质[7-8]。抗菌肽在体内发挥作用具有多种途径，静脉注射或皮下注射的药物输送方式对肽本身的稳定性要求不高，但口服给药无疑会使抗菌肽暴露在血清、消化道甚至细菌分泌的蛋白酶中[9]。因此，提高抗菌肽的稳定性成为加速抗菌肽在畜牧业生产中应用的因素之一。文章总结了提高抗菌肽稳定性的设计策略，期望为今后抗菌肽设计提供思路。 1 抗菌肽在动物生产中的应用 1.1 提高生长性能 抗菌肽具有活性高、毒性低、不易产生耐药性的优势，在动物生产中广泛应用。研究表明，在肉鸡日粮中添加0.1%的抗菌肽，可以显著提高肉鸡的平均日增重和平均日采食量，降低料重比，改善肉鸡的屠宰性能和肉品质[10]。为进一步系统量化抗菌肽对仔猪生长性能的影响，徐博成等[11]对数据库中31篇文献进行Meta分析，发现在饲粮中添加抗菌肽可以显著提高仔猪的平均日增重和平均日采食量，降低料重比和腹泻率。 1.2 调节免疫 抗菌肽又称免疫调节肽，是宿主防御系统重要组成部分。动物在面对外界病原菌时，抗菌肽通过调节机体先天免疫、促进肠道屏障和肠道黏膜免疫发挥作用[12]。葛龙等[13]发现，在基础日粮中添加抗菌肽 （300 mg/kg）可以显著提高广西麻鸡肠道中乳酸菌数量，降低大肠杆菌和沙门氏菌的数量；与对照组相比，麻鸡的胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数和血清中免疫球蛋白G （IgG） 含量分别提高17.65%、11.11%、31.25%、30.59%。 1.3 预防与治疗疾病 抗菌肽可以通过调节动物机体抗氧化能力，预防和减少自由基对机体造成的损伤，维持内环境的相对稳定[14]。在饲粮中添加不同水平的抗菌肽可以提高肉鸡血清中总抗氧化能力 （T-AOC） 和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px） 活性，降低丙二醛 （MDA） 含量[15]。奶牛乳房炎和断奶仔猪腹泻是动物生产中的常见的细菌感染类疾病。抗菌肽治疗由细菌引发的疾病具有明显效果。王静[16]利用重组牛LAP-CATHL2抗菌肽对奶牛乳房炎的动物模型进行治疗，通过加州乳房炎试验 （CMT） 检测发现，经抗菌肽治疗的奶牛体细胞数在72 h降至阴性范围。抗菌肽WK3在治疗E. coli K88构建的断奶仔猪腹泻模型时的疗效和恩诺沙星相近[17]。 2 抗菌肽对盐离子的稳定性 抗菌肽的阳离子氨基酸与病原菌上带负电的脂类通过静电作用相互吸引，疏水性氨基酸插入微生物膜中并对其造成物理破坏[18]。但在体内各种离子 （如Na+、K+、NH4+、Mg2+、Zn2+、Fe3+） 会与抗菌肽阳离子竞争菌膜脂质基团区域中的结合位点[19]，从而降低抗菌肽的活性，使其无法有效地发挥作用。因此，研究人员通过优化抗菌肽参数、设计多聚体以及提高二级结构稳定性等策略提高抗菌肽的耐盐能力。 2.1 优化抗菌肽参数 在动物体中的阳离子是影响抗菌肽发挥抗菌活性的重要因素，由于盐离子的电荷屏蔽作用，抗菌肽与细菌细胞膜的结合能力下降,会导致抗菌肽的活性下降[20-21]，因此适当提高电荷数能够提高抗菌肽的耐盐能力。研究发现，除Ca2+外，其他阳离子对高电荷抗菌肽PQ （IHKFWRCRRRFCRWFKHI-NH2）活性几乎无影响，而低电荷抗菌肽的最小抑菌浓度增加了4~8倍[22]。但仅仅依靠增加正电荷提高抗菌肽盐离子稳定性具有一定的局限性，且过高的电荷数往往伴随着更高的细胞毒性。 在一定范围内提高抗菌肽的疏水性有利于抗菌肽渗透细菌膜，从而获得更高的耐盐能力[23]。在所有疏水氨基酸中，芳香族氨基酸 （如Trp、Phe） 的侧链上具有较大的苯环结构，从而具有较高的膜界面亲和力，并且胆固醇的存在阻止了两性离子真核细胞膜的电荷和空间位阻，氨基酸及其类似物 3D 结构见图 1。Ramamourthy等[24]合成了一系列含有不同数量赖氨酸和色氨酸的多肽重复序列 （KWn-NH2），在高盐条件下，KW4和KW5肽仍表现出较强的抗菌活性。除了增加疏水性，在抗菌肽序列中引入非天然残基可以使其分子内部形成更加稳定的结构，从而达到提高抗盐能力的目的。Yu等[25]将色氨酸或组氨酸残基替换为体积较大的β-萘丙氨酸提高抗菌肽的盐离子稳定性，并且β-萘丙氨酸也能够增加抗菌肽疏水表面的两亲性优化多肽穿透细菌膜的能力。 图片 2.2 设计多聚体 添加二硫键可以使抗菌肽形成二聚体或者环化结构，有利于提高抗菌肽的盐稳定性[26-27]。Lee等[26]设计的4种多肽在正常环境下具有良好抗菌活性，但在150 mmol/L NaCl存在的条件下，与二硫键修饰后环化的二聚体相比，其他多肽的抗菌活性都受到不同程度的影响。Nan等[27]研究二硫键位置对二聚体抗菌肽耐盐能力的影响，在原有完美两亲性α-螺旋抗菌肽的基础上合成3个具有不同二硫 键 形 成 位 点 的 同 源 二 聚 体 多 肽 ， 结 果 发 现 ， 在150 mmol/L NaCl条件下，单体肽和二硫键位于中心位置的二聚体的抗菌活性降低 2~6 倍，而在分子两端形成二硫键的二聚体抗菌肽的活性依旧保持不变。因此，在分子Ｎ端和Ｃ端含有二硫键的抗菌肽二聚体具有更高的耐盐能力。 2.3 提高二级结构稳定性 除了利用二硫键使线性肽形成多聚体结构外，还可以采用提高螺旋度来维持抗菌肽的二级结构，从而达到耐 盐 目 的。Park 等[28]将 RLLR 序 列 进 行 5 次 重 复，使RLLR序列形成α-螺旋结构的模板肽，并将螺旋封顶序列 APKAM （N） 和 LQKKGI （C） 以 不 同 的 组 合 加 入[RLLR]n（n=2~5） 的 N-末端或 C-末端，结果发现，除N-[RLLR]2-C外，其他多肽的最小抑菌浓度均显著降低，其中模板肽[RLLR]5的耐盐能力最差，最小抑菌浓度增加到无盐条件下的 32 倍；使用 CD 分析计算所有多肽在200 mmol/L NaCl 存在下的 α-螺旋含量，发现模板肽的α-螺旋含量由72%下降至13%，仅在N端或者C端采用一个螺旋封顶基序的多肽，抗菌活性均伴随着α-螺旋含量的降低而减弱，而N-[RLLR]2-C的α-螺旋含量仅下降了3%，表明抗菌肽螺旋结构的耐受性对盐离子稳定性具有很大影响。Chou 等[29]使用精氨酸提供正电荷，以Asn-Gly、Pro-Gly和DPro-Gly作为β转角，使用多个重复的色氨酸提高多肽的疏水性，设计了一系列具有β-发卡结构的模板肽（WRXxRW）n，并对这些多肽C端酰胺化，从而增强多肽的稳定性；盐离子对多肽的抗菌活性几乎无影响，其中杀菌效果较好的 W2 （12 个氨基酸残基） 拥有与典型β-发卡结构的PG-1 （18个氨基酸残基）相同的活性，但W2具有的盐离子稳定性更强。这种结构由于氢键和疏水相互作用，从而获得了更高的稳定性，提高了多肽的耐盐能力。采用优化设计参数虽然可以增强抗菌肽的耐盐能力，但还应该考虑过高的疏水性以及完美两亲性所带来的细胞毒性问题，因此进行抗菌肽设计优化时应考虑所有参数之间的平衡关系。 3 抗菌肽对蛋白酶的稳定性 消化道以及微生物分泌的蛋白酶也可以对抗菌肽活性产生影响，如胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶等。抗菌肽需要依靠阳离子氨基酸以及疏水性氨基酸发挥抗菌作用，但阳离子氨基酸和大部分疏水性氨基酸是蛋白酶水解的目标，因此目前大部分抗菌肽无法通过口服方式给药，极大程度地限制了其在畜牧业和临床治疗中的应用。为了应对蛋白酶的切割，可采用许多措施延长抗菌肽在消化道内的半衰期，包括化学修饰、改变分子结构、非天然氨基酸改造、设计自组装纳米材料等方法。 3.1 化学修饰 常见的修饰类型包括抗菌肽 N-末端乙酰化和 C-末端酰胺化，这类方法可以在抗菌肽主要参数保持不变的条件下提高多肽稳定性。N-末端乙酰化可以使多肽获得对氨肽酶的抵抗能力，不易被血液中的胰蛋白酶降解[30]；抗菌肽C-末端酰胺化可以获得对羧酸酶的抵抗能力，增加电荷，提高杀菌效果[31]。除了上述两种末端修饰方法外，Li等[32]还采用了N-末端聚甲基化、乙二醇化、糖基化 和 脂 肪 酸 偶 联 等 化 学 修 饰 提 高 SAMP-A4（H-VRLLRRRI-NH2） 的抗蛋白酶能力。脂肪酸作为生物膜磷脂的重要组成成分，疏水性较高。脂肪酸修饰可以提高抗菌肽疏水性，增强其对微生物细胞膜的亲和能力，从而达到提高抗菌活性的目的[33]，而且可以阻断蛋白酶易损区，减少酶的降解，从而提高多肽的蛋白酶稳定性[34]，并且随着脂肪酸链长增加，多肽的抗菌活性和蛋白酶稳定性也得到了提高。 单一的化学修饰在提高抗菌肽的蛋白酶稳定性方面具有局限性，因此需要在此基础上考虑如何利用多种方法联合使用来进一步优化多肽的抗酶解能力。Liu等[35]采用单一和多个N-甲基化修饰筛选出具有较高抗蛋白酶水解能力但无抗菌活性的Anoplin类似物，使用脂肪酸进一步修饰，增加其抗菌活性，同时 C14-Anoplin 比亲本肽Anoplin抵抗胰蛋白酶水解的能力提高了103倍。 卤化反应是调节生物活性分子性质的常见策略，多达1/3的临床研究药物中含有卤素原子[36]。研究表明，卤素原子引入在控制药物的降解、膜透化活性以及分解代谢稳定性方面具有重要作用[37]。在氨基酸的侧链或骨架上对其氟化时，可以改变含有脂肪族氨基酸多肽和蛋白质片段的二级结构倾向，增强多肽抵抗蛋白酶分解的能力[38]。Jia等[39]通过将卤素-苯丙氨酸引入抗菌肽ITS的序列中，得到一批 Jelleine-I 卤代衍生物，与模板肽相比，Br-J-I和I-J-I对胰蛋白酶或糜蛋白酶的抑制作用提高了10~100倍。但引入卤化氨基酸提高多肽的抗酶解能力取决于卤素原子在氨基酸侧链上的取代位置和数量。使用环化可以改变多肽的二级结构提高蛋白酶稳定性，增加多肽的生物利用度。Etayash等[40]分别采用头尾环化、侧链和尾部环合、添加两个半胱氨酸形成二硫键的方法对IDR-1018进行环化，发现3种环化肽对胰蛋白酶具有120 min的耐受时间，而模板序列在不到30 min的时间内全部降解，说明环化的结构优化有助于提高多肽抗酶解能力，增强多肽稳定性。除了利用二硫键将多肽环化外，骨架环化也已经成为一种降低蛋白酶敏感性的策略，如采用连接线性肽的N端和C端或者自然存在的环肽支架提高多肽稳定性[41-43]。如将多肽C端和N端分别与其序列相同多肽的 N 端和 C 端连接环化形成二聚体，可以使体系当中活性肽的数量提高了 2 倍，增加细菌膜上局部的肽浓度，从而增强活性肽的抗菌活性[44]。 3.2 非天然氨基酸改造 天然抗菌肽和人工设计的多肽的一级结构通常是由L-氨基酸排列组合而成，将抗菌肽中易被蛋白酶水解的L-氨基酸部分或者完全替换为D-对映体可以有效提高抗菌肽蛋白酶稳定性。Jia 等[45]使用 D-氨基酸替代抗菌肽Polybia-CP序列中部分和全部氨基酸，全D-氨基酸衍生物和部分D-赖氨酸取代衍生物与胰蛋白酶和糜蛋白酶孵育 6 h 后仍具有抗菌活性。D-氨基酸还会对蛋白质的溶解度、构象和热力学稳定性产生影响，此外其在生物体组织中的异常积累可能会导致相关的疾病[46]。含D-氨基酸的抗菌肽在体内的生物降解性仍需要进一步探讨。 色氨酸类似物Azulenyl-Alanine是一种吲哚的假等构烃类似物，其常作为环境不敏感的探针用于抗菌肽的荧光研究。D'Souza 等[47]选用 Azulenyl-Alanine 对富含色氨酸抗菌肽 buCATHL-4B 进行替换，结果发现，序列中Azulenyl-Alanine 的存在可以使多肽不易被蛋白酶水解。对多肽链中单个氨基酸的侧链进行修饰也是提高抗菌肽稳定性的常用方法。精氨酸和赖氨酸是抗菌肽发挥活性的关键，但胰蛋白酶对抗菌肽具有高度裂解特异性。减少精氨酸侧链的一个碳（Tritrp-Agb）可以明显提高其对胰 蛋 白 酶 的 抵 抗 能 力 。延 长 精 氨 酸 侧 链 的 长 度（Tritrp-hArg） 也可以获得高稳定性的肽类似物。此外赖氨酸侧链长度的逐级递减伴随着逐步增强的胰蛋白酶水解稳定性[48]。Jia 等[49]将 3 种侧链长度逐渐缩短的赖氨酸衍生物引入Polybia-CP序列得到3个类似物，发现3个类似物在相同浓度胰蛋白酶作用下仍可以保持抗菌活性。 3.3 自组装纳米材料 金属离子在生物蛋白质折叠、酶反应以及电子传递等过程中发挥重要作用，是生物体必需的元素。铜离子和锌离子可以诱导肽进行自组装使结构更加稳定[50]。Peng 等[51]将终浓度为 1 mmol/L 的 HMPI 与 1 mmol/L 的CuCl2或 CuSO4在 37 ℃孵育过夜，得到 HMPI-Cu2+络合物，在维持抗真菌活性不变的同时，其抗胰蛋白酶水解的能力也得到提升，还能够降低HMPI对红细胞的溶血活性。目前，利用金属离子提高抗菌肽蛋白酶稳定性的分子机理还不明确，但可为研究人员提供一种新的思路。全新设计自组装肽的分子多价性、高效的生物活性和生物相容性为其用于药物载体、基因输送载体和免疫诊断等方面提供了可能性。研究人员常采用设计自组装多肽的方式提高抗菌肽稳定性。Lai等[52]利用C16作为自组装驱动力设计了原始两亲性树突状多肽SPDN，并在此基础上采用支化肽和 RP 基序设计了 C16-2RP 和 C16-3RP，在纳米粒子分别与8 g/L的糜蛋白酶和胰蛋白酶孵育后，多肽SPDN的抗菌活性几乎未发生改变。Yu等[53]将不同分子量的 mPEG-COOH 和 mPEG-NH2与 PG-1 的N端和C端酰胺化偶联，结果发现，NPG750与不同浓度胰蛋白酶孵育8 h后的抗菌活性仍然保持不变。 3.4 其他方法 部分研究尝试利用基因工程表达系统来规避以上方法中存在人工合成的成本高的问题，但是需要考虑仅天然氨基酸序列组成的多肽可以在基因工程表达中应用。蛋白酶抑制剂是在许多动物组织和体液、植物和微生物中广泛存在的一种调节分子，可以控制其对应靶蛋白酶的活性。蛋白酶抑制剂在一些情况下可以用来阻止蛋白酶加剧和失控的活性[54]。将蛋白酶抑制剂与抗菌肽偶联也是一种提高稳定性的办法。蛋白酶抑制剂可以与对应蛋白酶分子活性中心上的基团结合降低蛋白酶的水解能力。Yu 等[55]使用胰蛋白酶抑制剂 ORB-C 对 HC3 进行点突变得到4个杂交肽，发现除了TIH3其他3个多肽的抗菌效果强、蛋白酶稳定性高，且没有增加的细胞毒性。使用与蛋白酶抑制剂偶联合成杂交肽的策略能够有效地提高抗菌肽的蛋白酶抗性，但这种方法由于特异性靶点的限制仅能够针对部分的蛋白酶，无法应对消化道当中的其他蛋白酶，因此在实际应用中存在一定的局限性。 不同的蛋白酶对应不同的酶切位点，胰蛋白酶能够特异性切割赖氨酸和精氨酸的C-末端的肽键，疏水性氨基酸中苯丙氨酸、亮氨酸和色氨酸的C-末端的肽键会被糜蛋白酶和胃蛋白酶特异性识别并水解[56]。阳离子氨基酸和疏水性氨基酸在抗菌肽设计中是必要的因素，同时也是其发挥抗菌活性的关键。为了解决这个问题，基于Scheck hter和Berger创建的亚位点命名法，Tan等[57]总结了一套弱化蛋白酶裂解氨基酸排列的模板 （见图 2、表1），并在此基础上利用C14为多肽提供疏水性和自组装驱动力，每个苯丙氨酸和赖氨酸的两侧放置脯氨酸削弱胰蛋白酶和胃蛋白酶的作用，在肽链的不同位置连接聚乙二醇结构域，进一步提高其蛋白酶稳定性[58]。该方法设计得到的肽纳米颗粒能够抵抗高浓度蛋白酶降解。Zhu等[59]以精氨酸为阳离子抗菌肽作为正电荷来源，在精氨酸的N端和C端分别放置半胱氨酸和赖氨酸用于保护精氨酸不被胰蛋白酶切割，并在赖氨酸C端连接脯氨酸对其进行保护。为了削弱糜蛋白酶和胃蛋白酶对多肽的水解能力，选择异亮氨酸和缬氨酸作为疏水性氨基酸，得到了 XX(XCRKPX)nXX （n=2，3，4，5；X 为 I 或 V）序列模板，对C-末端进行酰胺化修饰来进一步提高稳定性。多肽Ⅱ-I4-I的抗菌活性高，在各种蛋白酶、生理盐条件下具有极高的稳定性。但目前有关多肽Ⅱ-I4-I的报道较少，多肽Ⅱ-I4-I能否在复杂的体内环境中依旧保持活性还有待探索。 图片 4 展望 目前，化学修饰虽然为抗菌肽设计提供了很多选择，但往往会对抗菌肽产生一些未知的影响，如化学结构改变、生物活性难以预测等，此外高昂的制造成本使化学修饰无法在生产实践中应用。在设计阶段合理安排氨基酸序列规避酶切位点可以有效地避免不同蛋白酶的特异性切割位点，而不采用其他的修饰，不仅可以减少生产成本，使生物表达系统进行批量化生产成为可能。但目前只有少部分有关于此方面的研究，仍需要大量试验进行探索。 在与模拟的肠液和胃液浓度非常接近的蛋白酶的作用下，抗菌活性保持不变的自组装纳米颗粒设计方法为提高抗菌肽稳定性提供了可能性，是未来的发展方向。除了通过不同的分子遗传学策略提高抗菌肽内在稳定性，稳定的治疗方法和给药方式也是饲用抗菌肽应用中不可忽视的因素，在提高抗菌肽稳定性的同时也应考虑其适用性。因此，仍需要进一步探索提高饲用抗菌肽的稳定性的方法。 免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可删除 |
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