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值得收藏，细胞破碎技术攻略大全！
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在生物学研究中，除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，经常会对细胞或组织进行破碎处理，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性，最终目的是获得细胞内的物质。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。 01 组织器官破碎方法 No.1 机械破碎 （1）研磨：研磨是将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。 （2）匀浆：匀浆这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min-20000r/min的内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒-20秒，停10秒-20秒，可反复多次。 （3）胶体磨：胶体磨的基本原理是流体或半流体物料在离心力的作用下，强制通过高速相对运动的定齿与动齿之间，使物料受到强大的剪切力，磨擦力、高频振动和高速旋涡等复杂力等作用，有效地被粉碎、乳化、均质、混合，从而达到精细超微的效果。定转子间的高速相对运动是使胶体磨工作获得物理微细度的主要条件，只有提高磨盘的精密度与线速度，才能达到良好的加工效果。 No.2 物理破碎 （1）压榨：压榨是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa-2000×105Pa的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高。 （2）冷热交替：冷热交替是在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎，细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此技术。 （3）反复冻融：反复冻融是将待破碎的细胞冷至15℃-20℃，然后放于室温（或40℃）迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞破碎。 （4）超声波：超声波是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防止过热。 No.3 化学与生物化学破碎 （1）有机溶剂：有机溶剂是利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此技术也可以与研磨法联合使用。 （2）自溶：自溶是将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为自溶法。该法使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也有可能会把某些要提取的有效成分分解。 （3）溶胀：溶胀是在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 （4）酶解：酶解是利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，酶解破碎适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，可采用溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶（来自蜗牛），将酵母细胞悬于0.1mmol/L柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.4）中，加1%蜗牛酶，在30℃处理30分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2%疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨联合使用。 02 细胞破碎方法 No.1 高速组织捣碎 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 No.2 玻璃匀浆器匀浆 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 No.3 超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 No.4 反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 No.5 化学处理法 有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 总之，无论用哪一种方法破碎组织细胞或组织，最终目的都是使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 |
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