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想要构建脉络膜新生血管模型，要注意哪些？
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脉络膜新生血管(choroidal neovascularition，CNV)又名视网膜下新生血管，是来自正常脉络膜组织的增殖血管，可通过Bruch膜破损处进入Bruch膜与视网膜色素上皮层(retinal pigment epithelium，RPE)之间、视网膜神经上皮层与RPE之间、RPE与脉络膜之间。CNV是许多脉络膜视网膜疾病，如年龄相关性黄斑变性渗出期、高度近视黄斑变性等发生发展中的重要病理机制。为了进一步发现这些疾病确切的发病机理，制作接近临床特征的CNV动物模型是必要的前提。 目前，动物模型主要有3种，激光诱导动物模型、生长因子诱导的动物模型、基因缺陷动物模型。其中激光诱导的CNV模型应用最为广泛。 动物的选择 主要有鼠、兔和猴等。鼠是目前诱导CNV模型应用最广泛的实验动物。 鼠 鼠诱导CNV的发生率较高，大约有60％～70％在光凝后短时间（1周）内即可产生，而且光凝斑荧光渗漏10～14天达到高峰，便于进行干预性研究；诱导CNV的条件也可标准化，价格相对便宜，便于基因操作，可用于观察单一基因过表达或低表达对CNV生成的影响。 不足之处是FFA中观察到的新生血管渗漏率低，仅为28％，且鼠的眼球较小，操作技术要求高。大鼠和小鼠CNV的诱发率无明显差异，小鼠眼球更小，操作要求更高，更适于进行有关基因敲除方面的研究。 猴 实验性猴CNV模型与人类疾病改变极为相似，不仅组织学改变一致，在眼底荧光素血管造影（FFA）中也具有荧光素渗漏的特征。这种新生血管一般发生在激光光凝后4周，可持续2～52周。增生移行的RPE细胞包绕新生血管后，新生血管荧光素渗漏的表现会越来越不明显。 尽管这种模型得到了一致的认可，但动物来源受限，费用较高，CNV诱发时间较长，发生率低，限制了其应用。 兔 兔产生的CNV在FFA中不具有荧光素渗漏的特征，加之考虑到兔的眼底血循环结构与人类有较大的差异，目前已基本不用兔做此类模型。 造模方法 一、激光诱导动物模型 造模方法： 健康棕色挪威大鼠，雄性，体质量180-200g，10%水合氯醛(0.35mL/100g体质量)腹腔注射麻醉。复方托吡卡胺滴眼液点眼散瞳。眼前放置滴加少量 1%甲基纤维素的盖玻片接触角膜，氪激光(波长647nm，光斑直径50um，功率360mW，曝光时间0.05s)距视盘2~3个视盘直径均匀光凝9个点，以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为准。 FFA的观察： 光凝后第3、7、14、21、30d随机选取4只大鼠行FFA检查。散瞳及麻醉方法同前，10%荧光素钠注射液0.5mL/kg腹腔注射后立即行FFA。FFA图像符合以下特点即认为CNV形成，①在造影早期即动脉前期或动脉期即显影。②与视网膜血管系统没有联系。③荧光素迅速渗漏，有一定的积存范围，后期形成高荧光区。将各时间段出现CNV光凝斑数目与该时间段的光凝斑总数的比值作为该时段的CNV发生率。 后续进行光镜观察、组织病理学CNV相对厚度测量、透射电镜观察。 优点： 激光诱导的CNV动物模型发生率较高，大约为 60%~70%，在光凝后短期时间（7d）内即可产生，而且激光斑的荧光素渗漏在 10~14d达到高峰，便于进行干预性研究；诱导CNV的条件也可标准化，价格相对便宜，是目前眼科诱导CNV最常用的动物模型。 二、生长因子诱导CNV模型 包括视网膜下注射载有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的腺相关病毒载体、重组VEGF明胶微粒诱导CNV模型、视网膜下注射碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）凝胶微粒诱导兔CNV模型、视网膜下注射bFGF/脂多糖诱导兔CNV模型、脉络膜上腔植入bFGF微渗透泵诱导猪CNV模型等。其中视网膜下注射载有VEGF基因的腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体诱导CNV模型是较为理想的模型。 造模方法1： 将2μl编码人 VEGF-A165腺病毒注射到大鼠视网膜下，CNV发生率为95%。 造模方法2： 在兔眼视网膜下注射5×106IU载有过表达VEGF-A165腺病毒载体诱导CNV模型，CNV发生率为83%。 三、转基因或基因敲除诱导 转基因和基因敲除建立CNV模型是一种新兴技术，针对CNV发展的关键因素建立基因工程模型，可从不同角度分析各分子对CNV形成的影响，包括： （1）VEGF164RPE65转基因小鼠； （2）双倍体（Tet/VMD2/VEGF）和三倍体（Tet/VMD2/VEGF/An2）转基因小鼠，视网膜可高表达VEGF，若同时视网膜下注射血管生成素2（angiogenin2，Ang2），能够100%形成CNV； （3）趋化因子CC类受体2（chemokine CC motif receptor 2，CCR2）/趋化因子CC类配体2（chemokine CC motif ligand 2，CCL2）基因缺失诱导小鼠CNV模型，其成模率大约25％； （4）载脂蛋白E基因（apolipoprotein E，ApoE）过表达小鼠CNV模型是研究AMD病变中自发性CNV形成机制的重要模型； （5）CCL2和CX3C趋化因子受体1（CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1）基因缺陷小鼠； （6）超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）基因缺陷老化小鼠； （7）极低密度脂蛋白受体（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）定向突变小鼠； （8）视紫红质基因启动子/VEGF过表达小鼠。 优缺点： 转基因或基因敲除诱导的CNV模型具有诱导快，发生时间短等优点，与CNV病理生理学关联性强，对CNV发生机制的研究具有针对性，同时研究者可根据不同需求选择模型并修改参数；缺点有CNV诱导率低、面积小、价格贵等问题。 总结 在众多建立CNV模型的方法中，激光诱导CNV模型条件较成熟，研究历史久，可靠性高，应用广泛。由于动物体内环境不同于人体内环境，各种方法诱导的CNV动物模型也仅能模拟人类CNV，不能完全代替人类CNV发展的自然过程，因此，研究结果仅能为CNV发病和机制研究提供实验理论依据。 |
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