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蛋白实验 | 蛋白质双向电泳
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蛋白质双向电泳是将蛋白质等电点和分子量两种特性结合起来进行蛋白质分离的技术。蛋白质双向电泳的第一向为等电聚焦( Isoelect rofocusing ,IEF) , 根据蛋白质的等电点不同进行分离; 第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE ) , 按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和分子量两次分离后, 可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。简明地理解，第一项进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。 第一向（等电点聚焦，IEF） 一、凝胶条的准备 以帽凝胶端（2个校准环：4mm和10mm）朝下，将4根玻璃管插入两个凝胶灌注装置的每个托架中，这样玻璃管恰好站在两个分隔室之一的“充填船”上。从玻璃管顶端到玻璃管底端拉入PP线（小心，线不易移动），否则以后将不能用它们将胶溶液拉上来。 溶解分离胶溶液和过硫酸铵溶液。必须监控凝胶溶液的温度，因为高温下（大于25℃）聚合作用太快。 分离胶溶液除气4分钟，在桌子边缘轻弹玻璃管壁，避免产生气泡。 融化帽凝胶溶液，除气，步骤同3。 用Gilson移液管加35μl APS到1365μl分离胶溶液中，溶液应小心摇晃，避免氧气进入胶内。 将分离胶溶液加到两个凝胶灌注装置的每一个充填船里（每4个管700μl）。所有的玻璃管末端都必须浸没于凝胶溶液中。 小心将PP线抽出，将凝胶溶液拉上至23mm的标记。 换充填船分隔室。 使用一个Gilson移液管，加10μl 0.8％ APS到390μl帽凝胶溶液中，轻轻振荡使之混匀。 在两个凝胶灌注装置的每个充填船中的空余分隔室内加入200μl帽凝胶溶液；凝胶溶液应到达17mm的标记。 移去充填船，允许凝胶溶液到达13mm的标记。经过这一步，有空气进入管子底端和4mm标记处。 聚合30分钟后，将PP线抽出，去除凝胶表面未聚合的溶液。在毛细血管口部滴加一大滴去离子水，这样在凝胶的上边形成一个潮湿的室，在凝胶和水滴之间形成一个气泡。用此方法形成一个潮湿的室，随后用Parafilm膜封上帽凝胶一侧。凝胶在室温过夜，可以使之进一步聚合。制备好的管子如果保存于室温，可以在第二天使用，或最迟在制备好第五天使用。 二、加样 将乙二胺加入阴极溶液，除气5min，下槽装阴极溶液。 融解Sephadex溶液，加入108mg尿素和10μl两性电解混合液到100mg Sephadex胶中，在涡旋器上充分振荡10～15分钟。 从凝胶灌注装置移走凝胶管，把它们插入聚焦槽的阳极部分，仍应看到13mm标记。帽凝胶一端朝上。 将阴极溶液加入管子的阴极一边，不要有气泡（事先已除去水）。 将聚焦槽的阳极部分安放到聚焦槽的底部，管子必须浸入阴极溶液。 除去水，并将加样侧干燥。使用一个伸长的巴斯德移液管或凝胶装填移液管头将水吸去，然后用滤纸条将凝胶表面干燥。 融解准备好的样品和覆盖溶液。 用凝胶装填移液管头，迅速在胶上覆盖大约2mm厚的Sephadex。 用一个凝胶装填移液管头，装入样品（1～15μl），加到Sephadex表面。加样时，尖端必须接触Sephdex表层，样品应小心加入，避免气泡。 使用凝胶装填头，轻轻在样品上加入5μl覆盖液并分层，不要使覆盖液和样品相混合。然后在毛细血管中加入阳性溶液，不要引入气泡。 所剩的阳极溶液加入上槽，用缓冲液覆盖所有的管子。 三、IEF电泳 凝胶平衡 融解平衡溶液（在IEF结束前1小时）。使用之前，在20ml平衡溶液中加入0.2g DTT。 IEF结束后，移去管子中的阳性和阴性溶液。 用87％的甘油溶液覆盖帽（cap）凝胶一侧。 加5ml平衡溶液到Petri盘。 用PP线挤出凝胶：PP线从帽凝胶一侧插入，管子加样一侧浸入去离子水，小心地向下挤出凝胶。与此同时可看到水中的覆盖液的溶解。凝胶被拉出5min后，用水迅速清洗挤压端。然后将管子保持在盛有平衡溶液的Petri-盘子上，整个凝胶被PP线拉到盘子里。每个盘子里可平衡两块胶。 室温振荡平衡凝胶10分钟整。 IEF之后，如果凝胶并不立刻使用，应倒出平衡缓冲液，并在Petri盘中－70℃保存。－20℃保存导致分辨率降低；液氮保存将破坏凝胶。 第二向（SDS－PAGE） 一、SDS-PAGE胶的制备 加热琼脂糖溶液至70℃使之液化。 冷却琼脂糖溶液至40℃，保持液态。 喷洒70％乙醇清洗玻璃板和隔板，并用Kimwipes刷干净。 融解凝胶溶液和APS。 将玻璃板夹入夹紧装置，该夹紧装置放在灌装支架的前面狭槽中，这样旋钮对着支架，而“尖角”向上。充分旋转旋钮以使厚的有机玻璃正好对齐后部边缘。这时大玻璃板可以放在有机玻璃板的前面，隔板沿着左边和右边的边缘。插入小板，用拇指轻压玻璃板和隔板以确使玻璃板位于底部。用钳子夹紧做好的“三明治”，后部边缘出现Newton环说明旋钮已经非常紧了。不要将旋钮旋得过于紧，否则玻璃板会被夹碎。将三明治从支架抽出，用拇指检查玻璃板和隔板是否与底部齐平。 在小玻璃板底部起172.5px处做标记，做为加样得辅助（凝胶长度为165px）。 将凝胶“三明治”装置夹到灌装支架上，旋钮向内，“尖角”向上。在有机玻璃板上加压以使凝胶三明治插入小突起下面。 将18ml凝胶溶液和1.2ml APS相混合，不要有气泡。溶液必须混匀，不要引进氧气。 含有凝胶溶液得容器放在加样槽的后面玻璃板上，这样凝胶溶液可以沿着加样槽从玻璃板流下而没有气泡，分离胶被加到标记处。 迅速用去离子水覆盖凝胶溶液，以利于聚合并使表面平坦。在凝胶一端用一巴斯德移液管防止搅动凝胶溶液，并使水在凝胶表面均匀地分层。60分钟后，凝胶可以用于SDS-PAGE电泳。 二、加样 用滤纸条去除凝胶表面的去离子水。 将凝胶“三明治”放到电极装置上（旋钮冲外，尖角向上）：首先将凝胶“三明治”放到电极装置的上面部分，向电极装置挤压它使下面一部分固定。 在平板凝胶表面加IEF凝胶：从平衡缓冲液中取出凝胶条，纵向放到厚有机玻璃板的边缘，尽量使凝胶条与加样槽的边缘靠近。使用小刮勺，将凝胶条轻轻向下推，使之小心的滑入加样槽。凝胶条必须位于SDS-PAGE的表面，没有气泡。 使用Pasteur移液管，将加样槽加满40℃的琼脂糖溶液（没有气泡），2分钟后，琼脂糖溶液应凝固。 在电极装置装入凝胶“三明治”以后，将BioRad槽注入620ml电极溶液，加溶液的时候避免泡沫和气泡的形成。内槽中电极缓冲液面应到达电极装置中红塑料点的位置。 三、SDS－PAGE电泳 在将槽封闭之前，需要确定有机玻璃表面是否干燥，以避免形成“渐进”电流，凝胶表面必须覆盖电极缓冲液。 电压必须如下表所示分段升高，电流和功率要调到电源的最大值。电流值如表所述并在每一部内逐渐减小。 SDS-PAGE结束之后，倒出电极缓冲液，从电极装置中取出凝胶“三明治”。轻微地弯曲隔板，将小玻璃板拉开以取出凝胶。凝胶可以转移到固定溶液中。 固定之后，可以采用几种染色方法。 注意事项 样品预处理是双向电泳的关键。等电聚焦电泳的样品中必须去除盐离子、色素、酚类和核酸等物质, 还要加入防止蛋白质水解的抑制剂, 所以根据不同样品需要查阅有关资料进行样品预处理。聚焦的好坏与两性电解质的质量也有关系。 |
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