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新虫 (小有名气)

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[交流] 慢病毒包装已有1人参与

包装步骤

Day1

（7:00 PM）铺板HEK 293T细胞
数量：400万/10 cm dish ；觉得计数麻烦的话，可以在293T细胞长到约90%汇合时，1:5传代（均分成5份），每1份的数目差不多就是400万了。

Day2

（3:00 PM）三质粒转染
在培养箱中恢复细胞状态约20h，此时可进行转染。三质粒的转染体系三种质粒的配比有许多种方式，目前MDL使用4:3:1的比例，即PxpAx2：PMD2g：PLVX(载有你基因的质粒)。10cm dish一般转染质粒的总质量为20μg，PEI的量为质粒的2.5-3倍（也就是50μg-60μg，一般推荐按照2.5倍来）。按照比例算下来，PxpAx2：PMD2g：PLVX的质量比为：(10ug:7.5ug:2.5ug)

注意：在提到质粒的量时，千万记得说质量而不是浓度，不然容易出错。

实验步骤：

1、取如上总质量为20μg的质粒添加到总体积500μL的DMEM无血清无双抗培养基中，记为A液，移液枪混匀20次；

2、取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg（也就是50-60μL）添加到总体积500μL的DMEM无血清无双抗培养基中，记为B液，移液枪混匀20次；

3、将B液逐滴滴加到A液中，移液枪轻柔混匀66次，室温静置15-20min；

4、将静置好的转染试剂（A+B）缓缓滴加到恢复状态20h的HEK 293T细胞中。

5、做好标记，记好转染时间、转染质粒、换液时间等参数提高实验重复性。

Day3

（9:00 AM）换液
转染后的第18h，将含有转染试剂的HEK 293T上清更换为10mL DMEM完全培养基；对于新手，为了防止你在换液时将细胞吹散，可以留3mL的液体在dish中，更换8mL DMEM完全培养基。

Day4

（3:00 PM）收集病毒液
在转染后的48-72h，为病毒生产的高峰期，一般我们收集转染后48h（换液后30h，产毒30h）的病毒液用于实验，足以满足大部分实验需求。收集病毒于15mL tube中，500g，5mL离心去细胞碎片和杂质，随后使用注射器和滤器进行过滤。收集后的病毒上清可以用来进行感染和储存。

三、慢病毒滴度测定

病毒滴度的单位为：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有转导功能的病毒颗粒的数目。

计算公式为：滴度=（感染时细胞数（个）*阳性细胞%）/病毒液体积（mL）

病毒液体积和感染时细胞数已知，需通过流式细胞术确认阳性细胞百分比。

滴度测定常常使用HEK 293T细胞，大致的原理为，将在DAY3收集到的病毒上清，按照梯度添加到293T细胞中，感染后48h检测阳性细胞的比例，从而确定病毒的滴度。

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