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蛋白纯化的步骤
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1、构建原核表达质粒：目的基因PCR，载体酶切，连接，转化，挑单克隆送测序； 2、将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）中，37℃培养过夜，挑单克隆小摇过夜； 3、小诱导摸索最佳诱导条件：将摇过夜的菌液1:1000接种到3mL LB中，37℃摇4-5h至菌液OD600=0.6-0.8，加入不同浓度IPTG（0.1-1mM），不同温度下诱导，随着温度降低，诱导时间延长，如37 ℃ 诱导4-5h，30°C诱导6h-8h，16°C诱导16-20h，取不同诱导条件下诱导前和诱导后的菌液，跑胶，考染，观察诱导结果；（一般来说，IPTG浓度越低，诱导温度越低，目的蛋白表达越慢，越利于蛋白质的正确折叠从而增加其可溶性，减少包涵体的产生）； 4、找到最适诱导条件后，将菌液1:1000接种到2L的LB中，37℃摇至菌液OD600=0.6-0.8，吸出20μL菌液留待跑胶(1)，然后在预实验得到的合适的诱导条件下诱导蛋白表达，吸出20μL菌液留待跑胶(2)； 5、取出诱导后的菌液，4000g，4℃离心15min； 6、弃上清液，称重，每克菌加入10mL Lysis buffer（1:100加蛋白酶抑制剂），重悬，冰上放置约30min； 7、压力破碎：放掉高压均质仪中的酒精，用水冲两遍，用Lysis buffer平衡一遍，加入菌液，加压（压力不要超过800kpa），菌液过三到五遍至透明不粘稠； 8、收集破碎后的菌液，12000g，4℃离心20min，将上清和沉淀分离，各留取20μL样品(3)(4)待跑胶； 9、将2mL Ni-NTA加入纯化柱，待乙醇滤过，用水冲洗，加入Lysis buffer平衡柱子； 10、用Lysis buffer将Ni-NTA重悬加入上清中，混匀，4℃摇床孵育2h； 11、将上清液4℃过柱，收集滤过液20μL(5)； 12、用5mL Wash buffer洗柱子3次，收集滤过液样品20μL(6)； 13、加入1mL Elution buffer，孵育5min，收集洗脱液，重复5次，收集5mL洗脱液于同一管中，留取20μL样品(7)； 14、将实验过程中得到的各个蛋白样品跑胶，考马斯亮蓝染色1h，脱色至背景蓝色较浅，可见清晰蛋白条带； 15、分析各个样品的蛋白条带情况，根据结果进行后续操作：若洗脱蛋白样品中蛋白无杂带或杂带少且浅，可进行透析与浓缩，若杂带多则需要再次纯化后进行透析与浓缩。 16、透析：将样品加入透析膜中，两端夹紧，4℃透析过夜； 17、浓缩：根据样品分子量大小选择合适的浓缩管4℃低速浓缩，浓缩后测蛋白浓度，分装标记，在液氮中速冻，然后冻存于-80℃冰箱。 |
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