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合肥肽库生物

新虫 (著名写手)

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[交流] 靶向细菌肽聚糖合成酶抑制剂的研究进展

摘要: 近年来, 由于抗生素的滥用, 使耐药菌株广泛出现, 已成为威胁人类健康的重大问题。研发具有新的作用机制的抗菌药物迫在眉睫。抗菌药物资源匮乏, 究其原因, 主要是由于有效的药物作用靶点数量不足, 远远不能满足当前防治的需要。因此抗菌药物作用靶标的筛选是新型抗菌药物研发的关键一步。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖, 肽聚糖是病原菌生存所必需的。Mur 酶 (MurA-F) 是肽聚糖生物合成必不可少的酶, 可以以此为靶标发现新的抗生素。本文详细介绍了 MurA-F 抑制剂的研究现状, 并总结了临床上缺少成功抑制剂的原因和所面临的挑战。
2012 年之前, 全球近 40 年无全新结构和作用机制的抗菌药品上市, 其中新型可药性靶标的发现相对缺乏是限制抗菌新药发展的瓶颈之一。因此, 针对全新靶点的抗菌新药的研发迫在眉睫。
细菌细胞壁是位于细胞最外的一层厚实、坚韧的外被, 具有固定细胞外形和保护细胞不受损伤等多种生理功能。细菌细胞壁由一些化学成分不同的物质组成, 如肽聚糖、磷壁酸、脂多糖、磷脂、外膜蛋白等, 在这些组成成分中对细胞壁的生理功能起主要作用的是肽聚糖, 除少数细菌如产甲烷细菌这类古细菌的细胞壁是由其他化学物质组成外, 几乎所有细菌的细胞壁都含有肽聚糖, 在 G+细菌中肽聚糖含量高达 30%～95%, G−细菌也有 5%～20%的含量。由于哺乳动物细胞内不存在与细菌类似的细胞壁结构, 也不存在合成细胞壁的各种生物通路, 因此, 与细胞壁合成相关的通路一直都是抗菌药物研究的热点。
肽聚糖是细菌细胞壁重要的组成部分, 是细菌生存所必须的, 它为细菌提供刚性结构使得细菌可在低渗环境中生存。近年来, 随着肽聚糖在细菌内的生物合成通路被逐步解析, 肽聚糖生物合成所涉及的每一个酶也成为发现新型抗生素的重要靶点[1, 2]。
在以往抗生素发现的进程中, 研究重点主要集中于肽聚糖生物合成的后半部[3−5]。然而, 最近几年研究人员也开始关注胞内肽聚糖合成所涉及的靶标酶尤其是 Mur 酶系[2, 6−8]。
MurA-F 催化 6 步酶促反应最终形成肽聚糖的先导物尿苷-5'-二磷酸 (UDP)-N-乙酰胞壁酸五肽 (图1)。MurA 和 MurB 以 UDP-N-乙酰葡萄糖胺 (UDPGlcNAc) 为底物催化形成 UDP-N-乙酰胞壁酸 (UDPMurNAc)。随后, Mur 连接酶 (MurC-F) 先后将 L-Ala、D-Glu、meso-diaminopimelic acid (革兰阴性菌) 或L-Lys (革兰阳性菌) 和二肽 D-Ala-D-Ala 连入 UDPMurNAc 形成 UDP-MurNAc-五肽[9, 10]。
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目前对肽聚糖生物合成通路中酶的底物专一性、动力学、催化机制和结构生物学研究的逐渐深入[6, 9−15]为抗结核药物的研究提供了重要的基础和保障。本文对 Mur 酶近 10 年所发现的小分子抑制剂的研究进展进行了综述和总结, 为本领域研究人员提供挖掘抑制剂的前沿方向, 为发现活性更为优异的药物先导物打下坚实的基础。
1 MurA 抑制剂
众所周知, 广谱抗生素 fosfomycin (化合物 1, 图2) 是 MurA 的抑制剂之一, 它能与 MurA 的活性位点(Cys115) 形成共价键。Fosfomycin 对 MurA 的抑制存在时间依赖性, 并且在底物 UDP-GlcNAc 存在的情况下抑制活性升高[16]。结核分支杆菌、沙眼衣原体和伯氏疏螺旋体等对于 fosfomycin 具有固有耐药性, 因为它们相应的 Cys 突变为 Asp[17]。另外, 细菌降低渗透压、修饰活性中心和产生相应的酶钝化 fosfomycin可产生对 fosfomycin 的耐药性[17], 因此, 当前迫切需要研发具有不同化学结构和作用机制的抑制剂。
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最近, Chang 等[18]报道了从 Neosartorya fischeri分离得到的燕麦曲菌素衍生物 (化合物 2, 图 2), 该类化合物是 MRSA 和 fosfomycin 抵抗的 MurA 的有效抑制剂。通过对 Novartis 化合物库进行高通量筛选, 2-aminotetralone 衍生物和 benzothioxalone 系列化合物被鉴定出来。2-Aminotetralone 衍生物 (化合物 3, 图 2), 对来自于 E. coli 和 S. aureus 的 MurA 的 IC50 在微摩尔级别, 并且显示出良好的抑菌活性, MIC 在 8至 128 μg·mL−1 之间。Benzothioxalone 系列化合物(化合物 4, 图 2) 对 MurA 的 IC50 在 0.25 到 18.54 μmol·L−1之间, 一些此类抑制剂对 S. aureus 的 MIC 在4 和 128 μg·mL−1 之间。
2 MurB 抑制剂
至今为止, 只报道了少数几种 MurB 的抑制剂。4-Thiazolidinone 衍生物 (化合物 5, 图 3) 是第一类被报道的 MurB 的抑制剂, 它是模拟烯醇式丙酮酸- UDP-GlcNAc 中的二磷酸胞苷部分设计的[19]。其杂环生物电子等排体, imidazolinone 衍生物 (化合物 6, 图 3) 显示出对 MurB 高效的抑制性, 并对 S.aureus显示出优异的抗菌活性[20]。
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Alkyl pyrazolidinedione 衍生物 (化合物 7, 图 3) 对来源于 S. aureus 和 E. coli 的 MurB 具有良好的抑制性 , 同时对革兰阳性细菌尤其是耐青霉素的Streptococcus pneumoniae (PRSP) 显示出中等的抗菌活性[21]。另外, 一系列 pyrazolidinedione 衍生物 (化合物 8, 图 3) 在低微摩尔浓度下对来源于 S. aureus和 E. coli 的 MurB 能够产生抑制作用, 同时对 MurA和 MurC 也具有中等的抑制性[22, 23]。
Mur 连接酶 MurC、MurD、MurE 和 MurF 具有3 个相同的活性结构域[24, 25]: N-端结构域 1、中心结构域 2 和 C-结构域 3 (图 4)。结构域 1 结合核苷底物。例如, 来自大肠中的酶, 由 5 个平行的 β-折叠被 α-螺旋包围组成, 其中 α-螺旋在 MurE 中为 2 个, 在 MurF中为 3 个, 在 MurC 和 MurD 中为 4 个; MurD、MurE、MurF 的中心结构域包含 6 个平行的 β-折叠, MurC则为7个。MurD和MurE中 β-折叠被 7 个 α-螺旋环绕, MurC 中 β-折叠被4个α-螺旋环绕, MurF 中 β-折叠被8 个 α-螺旋环绕, 这个结构域的两侧被更小的反平行的 3β-折叠包围; 结构域 3 包含 6 个 β-折叠, 其中 1个反平行的、5 个平行的, 这 6 个 β-折叠被 5 个 α-螺旋包围。这个结构域包含罗斯曼二核苷酸折叠并结合氨基酸基质。这些特点可被用来设计同时靶向多个酶的多靶点抑制剂, 使与靶标相关抵抗的发展的可能性降到最低。
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3 MurC 抑制剂
第一类 MurC 抑制剂是 phosphinate transitionstate 衍生物, 其抑制作用最强的化合物 (化合物 9, 图 5) 的 IC50 为 49 nmol·L−1。研究发现该类化合物的UDP 部分是活性必须基团[26]。
2004 年, AstraZeneca 公司通过高通量筛选化合物库获得一系列 benzofuran acyl-sulfonamides MurC 抑制剂。活性最高的衍生物 (化合物 10, 图 5) 对 E. coli来源的 MurC 显示出时间依赖性的、部分可逆的低微摩尔浓度 (IC50, 2.3 μmol·L−1) 的抑制作用。最近, 该公司又筛选获得了一个 pyrazolopyrimidine 化合物(化合物 11, 图 5), 该化合物对 E. coli 和 P. aeruginosa来源的 MurC 的 IC50 均在纳摩尔级别。
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Pfizer 公司报道了另一个有潜力的 MurC 的抑制剂。他们利用对 E. coli 来源的 MurC 进行高通量筛选获得一个可逆的小分子抑制剂 (化合物 12, 图 5), 其 IC50 为 30.2 μmol·L−1, 实验表明化合物 12 与 ATP竞争性结合 MurC, 其 Ki 为 8.2 μmol·L−1。然而遗憾的是化合物 12 仅能抑制部分来源于与 E. coli 紧密菌株的 MurC (如 Proteus mirabilis, IC50: 41.4 μmol·L−1; Klebsiella pneumoniae, IC50: 26.4 μmol·L−1), 对于来源于其他革兰阴性菌 (H. influenza, Acinetobacter baylyi, P. aeruginosa) 的 MurC 无明显抑制作用, 另外化合物 12 对 E. coli 的生长无明显抑制作用[27]。
4 MurD 抑制剂
MurD 催化 D-Glu 和 UDP-MurNAc-L-Ala 之间的酰胺键形成 UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu。由于 MurD对 D-氨基酸基质表现出非常高的特异性, 使得它被认为是发现选择性抗菌剂的最有希望的新靶标之一。以 MurD 为靶点的药物筛选研究已有多篇文献报道[9, 28]。通过计算机辅助设计获得的化合物 13 (IC50: 0.7 μmol·L−1) 是活力最好的大环类 MurD 抑制剂[29]。通过虚拟筛选获得 9H-xanthene 衍生物和 polycyclic杂环类抑制剂。化合物 14 是其中最有代表性的, 它对 E. coli 来源的 MurD 的 IC50 为 10 μmol·L−1 [30]。Benzene-1,3-dicarboxylic acid 衍生物也是通过虚拟筛获得的, 化合物 15 (图 6) 是其中活性最高的, (IC50: 270 μmol·L−1), 另外, 化合物 15 对 E. coli 来源的 MurE 也有抑制作用 (IC50: 32 μmol·L−1)[31]。
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下一代 MurD 抑制剂是带有谷氨酸结构基元的抑制剂, 最早的含谷氨酸的抑制剂是 phosphinate transition-state 类似物[32]。这个系列的抑制剂依然是至今已报道过的 MurD 抑制剂中活性最强的 (例如化合物 16, 图 6)。随着谷氨酸部分被确证是发挥 MurD抑制活性的关键部分, 对此类抑制剂其他部分改造的研究也在进行着, 引入磺胺基后得到了另一系列的 MurD 抑制剂。和次磷酸盐结构一样, 磺胺基的引入是为了模拟 MurD 四面体过渡态[33−35]。早期的萘磺胺类是 N-substituted glutamic acid 衍生物[34, 35], 化合物 17 (包含 D-Glu) 和化合物 18 (包含 L-Glu) 均可抑制E. coli来源的MurD, 包含L-Glu对映体 (化合物18) 的效价要比 D-Glu 衍生物 (化合物 17) 低的多[34]。对早期萘磺胺结构进一步优化得到的新的抑制剂, 其中活性最好的化合物 19 对 MurD 的 IC50 可达 85 μmol·L−1。通过 NMR 和考虑配体柔性和配体−酶特殊相互作用的分子动力学研究对萘磺胺和 MurD 之间的相互作用进一步分析解释了其抑制活性不高的潜在原因[36]。通过用更加刚性的环取代 D-Glu 得到了化合物 20 和 21 (图 6), 与原始结构的化合物相比, 对MurD 的抑制活性有所提高, 因此证实了构象限制的优势。化合物 20 与 MurD 共结晶结构揭示两个羧酸基团与母体化合物的 D-Glu 占据了完全一样的结合位点。
Benzylidene-2,4-thiazolidin-dione和2-thioxothiazolidin-4-onesubstituted glutamic acids 代表着另一大类MurD抑制剂。研究发现这类MurD抑制剂当D-Glu (化合物 22, 图 6) 被 L-Glu (化合物 23, 图 6) 取代后活性并未消失[37]。进一步研究发现, 当对取代的芳香环进行改变后, E. coli 来源的 MurD 抑制活性 (化合物24, 图 6) IC50为 45 μmol·L−1 [38]。一些 benzylidene-2,4-thiazolidin-dione 和2-thioxothiazolidin-4-one 类抑制剂与 MurD 复合物晶体结构的成功解析是这类抑制剂发展的一个里程碑, 并且揭示了它们的结合模式, 这两类抑制剂的结合模式非常相似。
来自不同菌种的 MurD 酶具有保守的催化活性必须的氨基酸残基。然而, 它们整个氨基酸序列的相似性非常小。因此, 只有少数化合物能够同时抑制不同种属的 MurD 酶也就不足为奇了。例如, 化合物 21和 24 能够在微摩尔水平抑制来自 S. aureus, S. pneumoniae, B. burgdorferi 和 M. tuberculosis 的 MurD 酶。
至今已有多个多肽和非肽类抑制剂被报道。两个九肽 (序列分别为 CPAHWPHPC 和 CSAWSNKFC) 显示出对 E. coli 来源的 MurD 良好的抑制活性[39]。
5 MurE 抑制剂
第一个被发现的 MurE 的抑制剂是亚磷酸盐 (化合物 25, IC50: 1.1 μmol·L−1)40]。类似于上述 MurD 的磺胺类抑制剂也可以抑制 MurE 的活性 (化合物 26, 图 7; IC50: 181 μmol·L−1)[31]。序列为 CQANLRSQC 的环肽对 S. aureus 来源的 MurE 有抑制活性[28]。MurE的多肽类抑制剂也被发现, 例如 MurEp1 对 MurE 的IC50 为 500 μmol·L−1 [41]。3-Methoxynordomesticine (化合物 27, 图 7) 是 M. tuberculosis 来源的 MurE 抑制剂。另一个最近发现的可抑制 M. tuberculosis 来源MurE 的抑制剂是化合物 28 (IC50: 75 μmol·L−1)[42, 43]。
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6 MurF 抑制剂
最初, 利用亲和选择筛选技术获得了两个非常有前景的 MurF 抑制剂 (化合物 29, 图 8; IC50: 1 μmol·L−1)[44]。它们与 MurF 的复合晶体结构证实了结合模型, 这些数据也为后来的结构优化及最终获得活性最高的化合物 30 (IC50: 22 nmol·L−1)[45, 46]奠定了基础。不幸的是, 这一系列化合物均未显示出抗菌活性, 而且对 E. coli AcrAB 外排泵突变菌株也未显示出活性。这些实验结果全都表明 MurF 可能不是肽聚糖生物合成的限速步骤[47]。
通过 MurF 的酶结合实验筛选获得一系列的8-hydroxyquinolines 化合物, 其可抑制 E. coli 来源的MurF 活性, 其中化合物 31 (图 8) 显示出显著的抗菌活性[48]。此外, 通过在这些化合物基础上构建的一个药效团模型获得两个 diarylquinolines 化合物 (例如化合物32, 图8), 可通过破坏细胞壁的生物合成抑制MurF活性。化合物32 还对 Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium 和 S. aureus 有抑菌活性, MIC是8 μg·mL−1 [49]。
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7 Mur 酶多靶点抑制剂
研究人员已认识到多靶点药物的治疗效果要比选择性单靶点药物的要高。但是设计多靶点药物仍面临着众多挑战, 例如保留类药特性和平衡各靶点之间的亲和作用[50, 51]。针对多靶点 Mur 酶抑制剂的研究已获得了一些具有适度多靶点抑制活性的化合物。
Wyeth 等[52]研究发现萘基特窗酸是 Mur 酶的多靶点抑制剂, 对 MurA-E, 显示出 IC50 在微摩尔级别的抑制活性。化合物 33 (图 9) 显示出对 9 个 Mur 酶均衡的抑制作用, 而且对 E. coli 和 S. aureus 具有显著的抗菌活性, 其 MIC 值分别为 2 μg·mL−1 和 1～2 μg·mL−1。
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最近, Perdih 等[53]通过虚拟筛选发现 benzene- 1,3-dicarboxylic acid 2,5-dimethylpyrrole 类衍生物具有 MurD/MurE 双靶点抑制活性, 并在此基础上经过结构优化发现了 5 个抑制水平在微摩尔级别的MurC-MurF 的多靶点抑制剂 (例如化合物 34)。Perdih等[54]还报道了 furan-based benzene-1,3-dicarboxylic acid 类衍生物对 MurC-MurF 的多靶点抑制活性, 其中, 化合物 35 还对 S. aureus 有抑菌活性, MIC 是 32 μg·mL−1。
8 结语
由于耐药菌的广泛出现, 使得新药的研究迫在眉睫[55, 56]。本篇综述以尚未开发的抗菌药物靶标——Mur 酶为切入点详细介绍了很多已报道的 Mur 酶抑制剂。Mur 酶被用于抗菌抑制剂靶标研究的原因如下: ① 它是细菌生存所必需的; ② X 射线晶体结构的获得, 显示了跨菌种的相似性, 并为以结构为基础的药物设计提供了可能; ③ 它们与哺乳动物的酶没有同源性; ④ 它们的复合底物和生化实验较易获得或实现; ⑤ 迄今已研制出很多的抑制剂, 证明 Mur 酶具有成药性[6, 9, 14]。
以 MurA 为靶点的抗菌药物的有效性, 已通过在临床上使用的小分子抗生素 fosfomycin 被证实。但是, 还有一些与其他 Mur 酶相关的问题在将来抑制剂的开发过程中需要牢记和克服[57]。至今为止还未有具有抗菌活性的 MurB-F 抑制剂明确作用模式的报道。主要原因是大多数抑制剂不能透过细胞壁或者被外排泵快速泵出。另外, Mur 系列酶在体内可能会形成复杂的多酶复合物, 并阻止抑制剂到达其活性位点。同时 Mur 系列酶容易对代谢通路中的产物产生反馈抑制。概括地说要获得具有良好抗菌活性的 Mur 酶抑制剂还有很长的路要走[57]。目前, 具有纳摩尔级别抑制活性和类药性的抑制剂仅局限于 MurF, 不可逆抑制剂仅在 MurA 中发现, 针对其他 Mur 酶的抑制剂还有待于进一步的设计开发。
众所周知, 作用于单靶点的抑制剂容易由于细菌结合位点的突变而失去活性。为了避免此种情况, 同时作用于多靶点的抑制剂被开发出来。尽管现阶段多靶点 Mur 酶抑制剂还处于概念验证阶段, 但相信随着进一步的结构优化和发展, 最终会产生具有良好抗菌活性的多靶点 Mur 酶抑制剂[50, 51]。
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