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抗真菌肽研究进展
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摘 要 ：有害真菌已造成植物真菌病害、食物污染和人类真菌感染等问题，给人们的生活和生产带来极大危害，且其逐渐增加对抗真菌药物的耐药性，导致真菌防治日益困难。传统的合成类抗真菌药物具有药物残留和毒副作用，已不能满足需求，作为生物机体天然防御分子的抗真菌肽已成为应对真菌危害及耐药性的重要研究对象。抗真菌肽能够抑制有害真菌，具有高效、广谱、安全的特性，且其独特的抑菌机理解决了真菌耐药性的问题，在真菌防治中逐渐受到关注。基于此，主要从真菌的危害以及抗真菌肽的来源、分离纯化方法、抑菌机理等几个方面进行分析与论述，以期为抗真菌肽的研究提供参考。 目前，植物真菌病害、食物污染和真菌感染给我们的生活和生产造成了极大的损失，同时真菌抗药性进一步增加了真菌的防治难度。抗真菌肽具有独特的作用机理，且不易产生耐药性，成为化学抗真菌剂的理想替代品［1］。抗真菌肽是一类由生物体产生的、用于抵御外界真菌侵害的小分子多肽，通常由 10-50 个氨基酸组成，带正电荷（+2 到 +9），具有两亲性［2］。随着研究的进行，发现某些抗真菌肽不仅对真菌、病毒、原虫和癌细胞等具有杀灭作用，还具有提高免疫力、加速伤口愈合等作用。相对于抗细菌肽，抗真菌肽的研究起步较晚。目前，抗菌肽数据库（APD）中约有 2 700 多种抗细菌肽，而具有抗真菌活性的肽仅有 1 043 种。虽然抗菌肽每年以 100 种左右的速度在增加，但抗真菌肽的数量还远少于抗细菌肽［3-4］。因此，研究与开发新型抗真菌肽，对于解决真菌污染具有重要的研究意义。 1 真菌的危害 真菌（Fungus）是独立于植物、动物和其他真核生物的一类重要微生物，它比病毒或细菌更加复杂。一方面，真菌表现出有益的特性，如部分真菌可以应用于酒类、面包、调味品等的发酵酿造，部分真菌可以分泌凝集素、抗真菌肽、酶制剂等［5］；另一方面，真菌也表现出危害性，如植物病原真菌引起植物真菌病害，食物腐败真菌则污染粮食和食品，而人类病原真菌直接导致人体真菌感染。 据统计，约 80% 的植物病害是由真菌引起的，发展中国家农作物的损失有 12% 以上是由真菌病害造成的［6］。常见的有霜霉病、白粉病、锈病、黑粉病、稻瘟病菌、玉米丝黑穗病、土豆晚疫病等真菌病害，对农作物的损伤极为严重［7］。许多食物，如水果、蔬菜、乳制品、肉制品、烘焙食品极易受到真菌污染，真菌的繁殖导致食品的腐败，部分菌株还会产生真菌毒素。这些毒素中部分是致癌物，对人类健康造成严重威胁［8-9］。此外，粮食储备期间，也会由于真菌的污染而发生霉变，造成极大损失，目前减少储粮真菌污染的有效杀灭手段还未出现［10］。真菌不仅危害植物、食物，还对人类的健康构成威胁，其中约有 400 种真菌可引起人类多种皮肤病和各种器官疾病［11-13］。据统计，发展中国家约有 45 亿人已受到不同致病真菌的威胁［6］。大多数人对真菌感染具有很强的免疫力，然而，当免疫系统崩溃时，真菌往往会引起疾病。 目前，针对真菌危害的主要防治手段是使用化学农药、食品防腐剂或临床抗真菌药物。但这些物质的使用一方面促使真菌产生抗药性 ；另一方面，随着食物链的传递，化学农药最终会在人体内富集或残留。因此，高效、安全、无残留的抗真菌肽应运而生，开发新型抗真菌肽成为人们关注的焦点，抗真菌肽的开发与应用是一个具有潜力的真菌防治手段［14-18］。 2 抗真菌肽的来源及分离纯化 生物体能够产生多种防御蛋白，使自己免受微生物、病原体和其他有害生物的入侵。这些蛋白主要有抗细菌蛋白、抗真菌蛋白、核糖体灭活蛋白、凝集素、核糖核酶和蛋白抑制剂等。Boman 等［19］首先从天蚕蛹淋巴液中发现了抗细菌性蛋白物质，经研究为抗菌多肽，后来发现其同样具有抗真菌作用。此后，人们从不同生物体中相继发现了抗真菌肽，除了从自然界中获取抗真菌肽，还可以人工合成抗真菌肽［20］。 不同生物体中抗真菌肽的结构不同、稳定性也存在差异，因此采用的分离纯化方法也不尽相同，目前还未形成一套标准的抗真菌肽纯化方法。但纯化操作主要包括原料的前处理、抗真菌肽的初步分离和抗真菌肽的纯化。首先根据抗真菌肽的来源确定原料的前处理方式，然后根据抗真菌肽的性质采取不同的分离纯化方法。初步分离方法主要有 ：盐析沉淀、等电点沉淀、低温有机溶剂沉淀、热沉淀、吸附法、透析和超滤等。上述方法只能获得多肽的粗提物，若想获得纯品还需进一步进行纯化处理。纯化方法主要包括电泳法、层析法（离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和作用层析等）和反相高效液相色谱法等。这些方法通常需要联合使用，才能达到抗真菌肽的纯化目的。 2.1 动物源抗真菌肽 2.1.1 来源 大部分动物（包括脊椎动物和无脊椎动物）可通过防御系统合成多肽类物质，以应对细菌和真菌的感染，还可以对病毒、原生动物的入侵做出反应。目前动物源抗真菌肽主要有昆虫抗真菌肽、海洋动物抗真菌肽、药用动物抗真菌肽等。 昆虫抗真菌肽作为一类动物源抗真菌肽已被广泛研究，目前已发现有几十种昆虫抗真菌肽。昆虫在脂肪体（相当于高等动物的肝脏）中表达抗菌肽，并在细菌或真菌感染时将其分泌到血淋巴（相当于高等动物的血液）中［16］。研究者利用致病真菌感染昆虫的方法获得抗真菌肽。Al 等［21］将酿酒酵母注射到烟草天蛾昆虫幼虫体内，从幼虫血淋巴中分离出了一种多肽，具有抗真菌活性。Maistrou 等［22］研究了白僵菌自然感染黄粉虫过程中产生的抗真菌肽，并测定了其对白僵菌的生物活性。 在海洋动物方面，抗菌肽主要来源于海洋无脊椎动物，包括刺胞动物、环节动物、软体动物、甲壳动物、棘皮动物和鱼类等［23］。Rose 等［24］从七鳃鳗（最原始的鱼类，只有先天免疫能力）中分离到了两种抗菌物质 ：溶菌酶和抗真菌肽。经证实，溶菌酶对革兰氏阳性细菌有效，对革兰氏阴性细菌或真菌无效 ；而抗真菌肽对青霉菌和曲霉菌具有抑菌活性。Carlos 等［25］对海洋蜗牛抗真菌肽进行分离纯化，并进行活性测定，发现这种肽具有抑制酵母菌和丝状真菌生长的能力，且对哺乳动物没有毒副作用。目前来自海洋动物的抗真菌肽种类较少，具有很大的开发空间。 从药用动物中提取抗真菌肽也是抗真菌肽的一种来源方式。Choi 等［26］从成年蜈蚣（节肢动物，在医学上被广泛应用于各种疾病的治疗）中获得一种新的牛乳铁蛋白肽（LBLP）。结果表明，LBLP 对真菌具有抑菌或杀菌活性，且不产生溶血性。LBLP通过在细胞膜上形成孔洞发挥了强大的抗真菌活性，最终导致真菌细胞死亡。 值得注意的是，抗真菌肽在动物机体的不同部位会产生不同的作用。Park 等［27］在对蜜蜂抗真菌肽的研究中，发现了一种蜜蜂抑制剂半胱氨酸绳结（AcICK）肽，它可作为一种抗真菌肽，也可作为一种杀虫毒素，它在蜜蜂体内的先天免疫反应中是一种抗真菌肽，在蜜蜂毒液中则是一种杀虫毒素。此外，在有毒动物（如蝎子和蜘蛛）、马蹄蟹、昆虫和植物中也发现了这种半胱氨酸绳结（ICK）肽［28-29］。这提示我们要注意动物源抗真菌肽的多重作用。 2.1.2 分离纯化 动物源抗真菌肽一般存在于动物组织和血淋巴等器官中，不同来源的抗真菌肽采用不同的处理方法。在血淋巴中，Riciluca 等［30］使用抗凝血物质收集蜘蛛的血液，离心去除血细胞，获得上清液。在动物组织中，Carlos 等［25］首先将海洋蜗牛进行均质化处理，然后离心获得抗真菌肽的上清液。 样品初步处理，随后采用不同的分离方法对获得的上清液进行纯化，如对蜘蛛上清液进行均质、酸化，反相高效液相色谱进行纯化获得抗真菌肽［30］。对海洋蜗牛上清液进行硫酸铵沉淀、离心、脱盐，反相高效液相色谱进行纯化获得抗真菌肽［25］。 2.2 植物源抗真菌肽 2.2.1 来源 植物被认为是地球上生物活性物质的最大来源，近年，从植物中获得的具有生物活性的多肽数量较多，但用于抑制有害真菌的量较少。目前抗真菌肽主要来源于植物的种子、果实、茎、叶等部位。 在植物种子方面，Lin等［31-32］首次从当地白菜种子中分离出一种与脂质转运蛋白显著同源性的抗真菌肽，其对尖孢镰刀菌和花生球腔菌的菌丝生长具有抑制作用，还能抑制 HepG2 和 MCF 癌细胞的扩散，具有多种生物活性。白承之等［33］从苦荞种子中分离出一种抗真菌肽，具有抑制白腐菌、绿色木霉、链格孢霉的作用。Ruan 等［34］从荞麦种子中也获得一种抗真菌肽，对植物病原真菌具有较强的抑制活性。可知，从植物种子中获得抗真菌肽是一个不错的选择。 在植物果实方面，Mandal 等［35］从天南星果中获得了一种新型抗真菌肽 Tn-AFP1，对热带假丝酵母菌的生长具有抑制作用，可以破坏酵母菌生物膜的形成。Wong 等［36］从云南豆中获得了一种抗真菌肽，能够抑制镰刀菌属和花生球腔菌属真菌，并对小鼠白血病细胞（L1210）、肝癌细胞（HepG2）和小鼠白血病（M1）细胞系的增殖具有抑制作用。同样的，Ma 等［37］在尼泊尔大红豆中也分离出一种抗真菌肽，其功效与云南豆分离获得的肽相差不大，能够抑制镰孢菌和花生球腔菌的菌丝生长，对 L1210 白血病细胞和 MBL2 淋巴瘤细胞均具有抗增殖作用。基于此，我们推测植物果实来源的抗真菌肽可能具有多种生物活性。 在植物其他器官方面，如植物叶、茎、花中也分离出了抗真菌肽。Khani 等［38］从木香叶片中提取了抗真菌亲水性肽 Skh-AMP1，其对致病性曲霉菌、念珠菌具有生物抑菌活性。Rogozhin 等［39］在鹰嘴豆草不同器官（叶片、茎、花和种子）中发现了一种共同的多肽组分 SMamp3，在叶片中含量最高，其次是在茎、花和种子中。分离获得的这种多肽组分对植物病原真菌表现出了强大的抗真菌活性。 2.2.2 分离纯化 对于来源于植物种子、果实和茎、叶等的抗真菌肽，一般首先要将植物组织进行切段粉碎和均质化处理。例如，对天南星果实果肉进行清洗风干，采用乙酸溶液进行均质，离心后获得抗真菌肽的上清液［35］。对蛹虫草则在液氮中用杵将其均质，蒸馏水提取，然后离心获得上清液［40］。对荞麦种子清洗风干、磨碎、磷酸盐缓冲液浸提、离心等操作，以获得上清液［34］。 植物样品经过上述预处理获得提取液后再进一步进行纯化，如对天南星果含肽的上清液进行有机溶剂（丙酮）沉淀、利用反相高效液相色谱法进行纯化获得了抗真菌肽［35］。对豆树种子均质上清液进行硫酸铵沉淀、透析，然后经过离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化多肽［41］。 2.3 微生物源抗真菌肽 2.3.1 来源 微生物是一个巨大的宝库，抗真菌肽来源丰富。目前，微生物源抗真菌肽的研究重点是高产多肽微生物的选育。 研究发现，产抗真菌肽的微生物以细菌为主，主要有芽孢杆菌和类芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、爱媛类芽孢杆菌等。于杰等［42］获得一株枯草芽孢杆菌 B25，所产的抗真菌物质能有效抑制香蕉枯萎病镰刀菌以及其他几种热带植物病原真菌并具有耐酸和耐热的特性。Ji 等［43］获得一株产抗真菌肽的地衣芽孢杆菌，所产抗真菌蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性，并具有良好的热稳定性，在植物病原真菌的生物防治方面具有潜在应用价值。Naing 等［44］获得一株爱媛类芽孢杆菌 MA2012，所产抗真菌肽对植物病原真菌和炭疽病菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉菌和立枯丝核菌具有抑菌活性。芽孢杆菌或类芽孢杆菌在生长过程中会产生芽孢，能够抵御外界环境的变化 ；在发酵代谢过程中会产生抑菌物质，可以抑制多种有害菌。因此，大量具有产抗真菌活性物质的芽孢杆菌被分离出来，其他种属细菌也能产生抗真菌肽，但种类较少。 除了细菌， 某些真菌也可以合成抗真菌肽。gargouri 等［45］从当地曲霉菌中得到了一种新型抗菌肽 AcAFP，对赤霉病菌、黑曲霉、灰霉病菌、链孢霉菌等菌的菌丝生长均具有强烈的抑制作用。Wang［46］和 Chu［47］分别从食用菌杏孢菌子实体和平菇子实体内分离获得了抗真菌肽。 海洋中产抗真菌活性物质的菌株主要是放线菌。如国家海洋局第一海洋研究所在海洋中分离得到一株海洋链霉属放线菌，对其发酵上清液进行提取分离， 获得3 个单体活性化合物 ：salicylamide（1）、iturin A-2（2）和 daidzein-4'，7-di-α-L-rhamnoside（3），这 3 种物质对植物病原菌稻瘟病菌、黄瓜灰霉病菌、水稻纹枯病菌等均具有抑制活性［48］。马桂珍实验室在连云港海域的海泥中分离获得一株海洋放线菌优良菌株 BM-2，分离纯化出 4 种具有抑菌作用的活性物质，对多种植物病原真菌及病原细菌均具有较强的抑制效果［49］。随着人们对陆地微生物资源的大量开发，发现新型抗真菌物质的可能性在不断下降。从海洋中筛选产抗真菌肽的菌株是一个不错的选择，但海洋微生物具有特殊的生长条件，如高盐、高压、低温、低氧和低光照等，对抗真菌肽菌株的筛选是一个巨大的挑战。 2.3.2 分离纯化 来自于微生物发酵产生的抗真菌肽，一般存在于发酵液中，只需通过过滤或离心的方法去除菌体即可获得含肽的上清液。例如，对解淀粉芽孢杆菌 BW-13 发酵液进行离心，0.22 μm 微孔过滤器过滤，获得发酵滤液，然后进行分离［50］。对枯草芽孢杆菌 1.88 株发酵液进行离心，去除菌体和沉淀，然后进行后续操作［51］。 获得含肽上清液后，再经过后续初步分离和纯化进行分离。微生物来源的抗真菌肽种类较多，其分离纯化方法也较多，目前用于分离纯化蛋白质的方法亦可以用在抗真菌肽的纯化中。如盐析沉淀法、等电点沉法淀、超滤或纳滤技术、吸附技术、分子筛层析技术、离子交换层析技术、高效液相色谱分离技术等［50-54］。Zhao 等［52］ 在发酵液中加入硫酸铵，其饱和度为 30%-40%，从芽孢杆菌 BH072 发酵液中获得粗提液，然后利用 Sephadex G-75 凝胶过滤、D201 树脂阴离子交换层析进行纯化，获得了抗真菌肽。Rong 等［53］采用甲醇萃取法从内生芽孢杆菌 B21 发酵液中获得粗提液，后经硅胶柱层析、高效液相色谱法进行纯化，获得了抗真菌肽。Skourigargouri 等［45］将曲霉菌发酵上清液在 70℃条件下处理 10 min，经过离心去除沉淀，然后进行超滤和反相高效液相色谱纯化，获得了抗真菌肽。严海娇等［54］在发酵液中加入硫酸铵，其饱和度为 70%，从短小芽孢杆菌 HN-10 发酵液中获得多肽沉淀物，然后采 用 AB-8 大 孔 吸 附 树 脂、Sephadex G-100 凝 胶 和半制备型反相高效液相色谱进行纯化，获得了抗真菌肽 P-1。 在抗真菌肽分离纯化操作中，具体采用的方法要根据发酵液的特点进行选择，同时还应考虑肽的热稳定性、酸碱稳定性、有机溶剂稳定性等特性。表1汇总了部分抗真菌肽的提取、分离与纯化方法。 图片 2.4 人工合成抗真菌肽 天然来源的抗真菌肽虽然种类丰富，但其或多或少具有含量低、稳定性低、分离提取步骤繁琐、成本高等缺点。随着分子生物学和生物信息学的发展，采用基因工程技术和生物信息学手段实现抗真菌肽的人工合成，这也逐渐成为抗真菌肽来源的重要方式之一［20］。Garibotto 等［55］ 基于抗真菌肽的阳离子性、两亲性、氨基酸长度及序列、二级结构等特性，利用计算机辅助设计，合成了一系列新的含有 9 或 11 个氨基酸的小肽，它们具有潜在的抗真菌作用，其中肽段 RQWKKWWQWRR-NH2、RQIRRWWQWRR-NH2 和 RQIRRWWQW-NH2 对致病性新生隐球菌和白念珠菌表现出强烈的抑制作用。这些研究有助于人们了解抗真菌肽的基本结构，并通过结构预测合成相关的抗真菌药物。 人们利用现代技术对天然来源的抗真菌肽进行改造，增强其稳定性和抗菌活性。罗振华等［56］对MAF-1（家蝇幼虫血淋巴分离的一个抗真菌肽）的结构功能域进行人工改造，获得了一个含 26 个氨基酸的抗菌肽 MAF-1A，对白色念珠菌及其耐药菌均具有良好的抗菌活性。陈明明［57］又以抗真菌肽MAF-1A 为模板，采用氨基酸替代法对其氨基酸序列 进 行 改 造， 获 得 了 MAF-1C、MAF-1D、MAF-1E三种衍生肽，并对其活性进行了比较MAF-1C 对白色念珠菌的抑菌活性明显优于模板肽，且对白色念珠菌生物膜的形成以及成熟生物膜均具有抑制活性。 人们还利用基因工程技术把抗真菌肽基因转入植物中以抵御植物有害真菌的侵扰。FernandezBidondo 等［58］把编码抗真菌肽的基因导入马铃薯中，获得了表达抗真菌蛋白的马铃薯转基因株系，并监测了抗真菌肽的过度表达对非目标土壤微生物（丛枝菌根真菌）的影响，表明转基因马铃薯具有抵御有害真菌的能力，且对丛枝菌根真菌的定植及生长无影响。Banzet 等［59］研究了来自昆虫的两种抗真菌肽 drosomycin 和 heliomicin 对体外植物病原真菌的抑制活性，并将其基因转入烟草中。这两种基因在烟草中均能够表达，并且对植物病原真菌的抑制活性还有所增加。此外，也有人利用酵母表达系统来表达抗真菌肽，Sang 等［60］把果蝇中编码抗真菌肽的基因在毕赤酵母中进行表达，表达的抗真菌肽成功分泌到培养基中，并对试验真菌表现出了抑制活性。表 2 总结了不同来源的抗真菌肽及其所具备的生物活性。 图片 2.5 快速筛选与纯化方法 在抗菌肽的分离纯化中，传统的方法复杂繁琐，近年来，研究者开发了一系列抗菌肽的快速筛选与纯化方法，如抗菌肽 - 细菌吸附结合法、细胞色谱法、模拟细胞膜色谱法、毛细血管法、薄层色谱自显影法和高通量鉴定法等［61］。唐文婷［62］研究了基于肽 - 膜相互作用的模拟细胞膜的抗菌肽筛选方法，根据抗菌肽与模拟细胞膜的相互作用原理，建立了一套高效、快速的抗菌肽筛选与纯化方法。目前，关于抗真菌肽快速筛选与纯化方面的报道较少，但随着研究的深入，这些方法在抗真菌肽的快速筛选方面将发挥重要的作用。 特别是 Marie 等［63］提出了一种基于 diS-C3（3）荧光探针的方法，能够在 96 孔板中进行高通量筛选抗菌物质，并利用从蜜蜂毒液中分离的抗菌肽 LLIII（具有抗真菌活性）、它的合成类似物 LL-III /12和奥替尼啶双盐酸盐类似物 MAC-1/31（具有抗真菌活性），这 3 种物质进行抗真菌物质高通量筛选方法的验证，证明了该方法的可靠性。 研究者从不同来源的材料中获得了抗真菌肽，来源最多的是微生物源抗真菌肽。随着研究的深入，具有抗细菌、抗真菌作用的微生物已经被广泛分离出来，资源相对枯竭。从海洋中筛选具有抗真菌作用的微生物是一个新的选择，但需要面临的是海洋特殊的生理条件及后续的发酵生产，这些都是抗真菌肽资源开发中的挑战。从动物和植物中分离获得的抗真菌肽相对较少，重点在于对动物和植物资源的选择，一些本身具有抗菌作用的动物和植物能提高获得抗真菌肽的机率，如药用植物和药用动物。在人工合成方面，抗真菌肽数据库的建立和结构解析更有利于改造或合成更多稳定性高、毒性低的抗真菌肽。 抗真菌肽分离纯化的手段多是常见的分离蛋白质的方法，程序比较繁琐，近年来，高通量快速筛选方法的确立加速了抗真菌肽的开发进程，值得人们尝试。 3 抗真菌肽的抑菌机理 目前对抗菌肽抑菌机理的研究，多集中于抗细菌，且研究得较为全面，但对抗真菌机理的研究较少。不同于细菌，真菌细胞壁成分复杂，且存在如线粒体、内质网等特有细胞器。因此，对细菌的作用机理研究不能完全涵盖对真菌的作用。抗真菌肽抑制真菌的机理研究主要集中于对细胞壁、细胞膜、细胞器、胞内大分子 DNA 和蛋白质的作用。 3.1 对真菌细胞壁的作用 真菌细胞壁是细胞正常生长和维持生理功能所必须的一种细胞结构，能够对抗细胞的膨压，防止细胞裂解，对于维持真菌细胞的形状和完整性至关重要。真菌细胞壁主要由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白、脂质等组成（图 1）。通常采用电子显微镜（扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等）结合荧光探针标记技术研究抗真菌肽对细胞壁和细胞膜的作用［70］。Mizuhara 等［71］从一株链霉菌 HA125-40 发酵上清液中分离获得一种抗真菌环肽——环噻嗪霉素 B1（CTB1），结果显示，CTB1 主要通过与几丁质结合而引起了细胞壁的破裂，从而导致了真菌细胞的死亡。抗真菌肽还能导致细胞壁破裂，高霞［72］利用透射电镜观察到酵母菌经抗真菌肽 APS 处理后，细胞壁出现裂口，细胞膜结构不完整，胞浆内容物泄漏，细胞出现空泡。 图片 3.2 对真菌细胞膜的作用 抗真菌肽对细胞膜的渗透作用，这一过程主要取决于抗菌肽和目标细胞膜的物理化学性质。目前，关于抗菌肽渗透细胞膜的机制已经形成 3 个作用模型 ：桶板模型、毯式模型（图 2）和环型模型［73-75］。例如，Choi 等［2］研究抗真菌肽 astacidin 1 抑制白色念珠菌和毛孢子菌的抑菌机理，通过流式细胞检测和 K+ 释放测定表明，细胞膜发生渗透和 K+ 释放诱导的膜去极化。通过模拟白色念珠菌膜脂质体的钙素渗漏实验表明，膜的渗透作用是由成孔机制驱动的。Jin 等［76］获得一种抗真菌脂肽杆菌霉素 D，利用扫描电镜和透射电镜研究它对炭疽病菌的抑菌机理，结果表明，它主要损伤炭疽病菌的菌丝和孢子，并使细胞膜形成孔洞，导致细胞内的细胞质和细胞器渗出。Han 等［77］研究了芽孢杆菌 L-H15 分泌的新型抗真菌环肽 P852 对尖孢镰刀菌细胞形态和膜透性的影响，通过电子显微镜、扫描电子显微镜、透射电镜和荧光技术发现，P852 引起了尖孢镰刀菌细胞的形态学变化，细胞膜形成孔洞、胞内组织被破坏、最终细胞裂解死亡。 图片 3.3 对真菌细胞器及胞内大分子的作用 真菌细胞器主要有线粒体、核糖体、液泡、内质网、鞭毛等。抗真菌肽对细胞内物质的作用主要包括 ：阻断细胞内核酸的合成、抑制细胞壁和蛋白质合成、抑制细胞内酶活性等（图 3）。有时，抗真菌肽对真菌的抑制作用是通过对细胞膜的渗透作用以及对胞内细胞器共同作用的结果。Lee 等［78］研究了人工合成的 14-螺旋b肽与人工合成脂质囊泡膜之间的相互作用，研究结果表明，14-螺旋b肽对人工合成脂质囊泡膜具有渗透作用 ；进一步采用荧光标记法追踪 b 肽在细胞内的定位，结果显示，b 肽进入细胞后，依次破坏细胞核和液泡，导致细胞死亡。 图片 通常采用SDS电泳、DNA凝胶阻滞、荧光光谱分析、流式细胞技术、蛋白质印记法等方法研究抗菌肽进入胞内的作用情况［70］。采用 qPCR 转录组学和 iTRAQ 定量蛋白质组学技术，通过生物信息学分析抗菌肽作用后关键基因和蛋白的表达差异，研究对胞内大分子 DNA 和蛋白质的抑制作用［79-80］。Han 等［81］利用 iTRAQ 定量蛋白质组学技术分析串珠镰刀菌经抗真菌肽 AMP-jsa9 处理后的蛋白含量，发现有 162 个差异表达蛋白（59 个上调，103 个下调），同时，AMP-jsa9 还导致了几丁质、麦角固醇、NADH、NADPH和ATP表达水平的降低。 综上可知，抗真菌肽一般通过对细胞壁、细胞膜、胞内大分子单独作用或共同作用来达到抑制或杀死真菌的作用。 在对抗真菌肽抑菌机理的研究中，对真菌细胞壁、细胞膜的作用和对细胞器及胞内大分子的作用是研究者重点关注的内容，也是抑菌机理研究的基础内容。近年来兴起的qPCR转录组学和 iTRAQ 定量分析蛋白组学技术具有快速、灵敏、定量分析的优点，主要是利用生物信息学分析抗菌肽作用前后关键基因和蛋白的表达差异，已经被越来越多的研究者所应用。在抗菌机理的研究中，把基础技术和新型技术相结合，能更好阐明抗真菌肽的抑菌机理。 4 结语 随着有害真菌抗药性的增加，抗真菌肽由于其独特的抑菌机理进入了人们的视线，开发新型抗真菌肽成为研究的趋势。围绕抗真菌肽，研究者进行了广泛的研究，但仍需关注以下几方面 ：（1）寻找稳定性好、对机体无毒副作用的抗真菌肽仍然是目前的任务之一 ；（2）对现有抗真菌肽作用机制的认识与探索，以及解决目前分离纯化成本高的问题也是抗真菌肽研究的一个方面 ；（3）植物生防菌株的筛选，以及将不同来源的抗真菌肽应用到植物真菌病害防治和食品防腐中，也是需要关注的方向 ；（4）在应对人类真菌感染上，将抗真菌肽与现有抗真菌药物联合使用是研究的一个方向，这样不仅可以提高治疗效果，还能够降低二者用量。 免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可删除 |
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2023-07-14 10:49
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专注多肽(金币+1): 谢谢参与
2023-07-14 19:02
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tzynew4楼
2023-07-14 22:15
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