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放线菌诱变体系01
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| 请问各位谁知道放线菌UV诱变的参考值是多少？谢谢诶 |
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啥是：放线菌UV诱变的参考值 啊？ 不如你去google 或查学校的中文期刊（维普和万方），来的更专业、更快些！ 关键词就是：放线菌+紫外诱变 看看，我2min 就搜到一些啦！ 文中蓝色的是我的做法。实验室有专门的紫外小灯管做的紫外诱变箱，里面放几本书，就算调节平皿到灯管的高度了。 --------------------------------------------------------------------------------------- 紫外线是波长136~390毫微米的短于紫外波长的射线，它是一种非电离辐射，能使被照射物质的分子或原子中的内层电子提高能级跃迁到能量高的外层轨道（称为激发），导致分子的理化变化。 DNA分子上的碱基对强烈吸收紫外线，而且嘧啶比嘌呤敏感100倍。紫外线辐射能引起DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联，以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，但最主要的则是形成嘧啶二聚体，他会阻碍双链的解链和复制，阻碍碱基的正常配对，从而导致基因突变。它的遗传效应主要是引起GC→AT 的转换或移码突变。 由于存在光复活作用，即白光照射能活化光激活酶并将嘧啶二聚体解开而使DNA恢复正常，故辐照和处理后的培养应避免可见光照射（应在红光下操作）（我就没有这么做，半小时内就可以直接划平板培养，很省事的）。 测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作为相对剂量）两种。 微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射距离和时间。如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的时间成正比，故照射时间的长短可作为相对剂量。一般用15W的紫外灯，距离固定在30厘米左右，选用致死率达90~99.9%所需的辐射时间进行诱变处理。但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需辐照3~5分钟，芽孢要10分钟，芽孢杆菌的营养体要1~3分钟，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用30秒，放线菌的分生孢子用30秒~2分钟。 辅射不宜在肉汤等成分复杂的液体中进行，以免化学反应的干扰；同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。 （我是在灭菌平皿中加生理盐水（大约3-4 mm厚度）然后加孢子直接照，从1分钟到 15分钟的都有，然后都去涂平板了，一次就涂上50多个平板） 照射前紫外灯宜先开灯预热20~30分钟，使光波稳定。 -------------------------------------------------------------------------------------- 紫外线诱导提高重寄生放线菌PR和F46活性的研究 Study on the Mutations Induced by Ultraviolet Radiation Affecting Hyperparasites Strain F46 and PR <<西北农业学报>>2005年 第14卷 第03期 作者: 杨洪俊, 宗兆锋, 郭小芳, 期刊-核心期刊 ISSN : 1004-1389(2005)03-0022-04 利用紫外线照射诱导两种重寄生放线菌PR和F46,并对诱导产生的诱变菌株的特性进行了初步研究.结果发现,诱变菌株菌落的基内菌丝的颜色与出发菌落的明显不同.在适合度上,诱变菌株的菌丝生长量有所下降,而在产孢能力、重寄生能力方面则高于出发菌株.诱变菌株对常用化学杀菌剂的抗药性测定结果显示,诱变菌株与一些常用化学杀菌剂是可以混合使用的. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 紫外线诱导提高重寄生放线菌PR和F46活性的研究 Study on the Mutations Induced by Ultraviolet Radiation Affecting Hyperparasites Strain F46 and PR 添加成功！ 您可以在“我的服务”中查看您添加的引用通知列表，并且配置获取通知的方式。 关闭 下载PDF阅读器利用紫外线照射诱导两种重寄生放线菌PR和F46,并对诱导产生的诱变菌株的特性进行了初步研究.结果发现,诱变菌株菌落的基内菌丝的颜色与出发菌落的明显不同.在适合度上,诱变菌株的菌丝生长量有所下降,而在产孢能力、重寄生能力方面则高于出发菌株.诱变菌株对常用化学杀菌剂的抗药性测定结果显示,诱变菌株与一些常用化学杀菌剂是可以混合使用的. 作 者： 杨洪俊 宗兆锋 郭小芳 YANG Hong-jun ZONG Zhao-feng GUO Xiao-fang 作者单位： 杨洪俊,YANG Hong-jun(西北农林科技大学植保学院,陕西杨陵,712100;廊坊市林业局,河北廊坊,065000) 宗兆锋,郭小芳,ZONG Zhao-feng,GUO Xiao-fang(西北农林科技大学植保学院,陕西杨陵,712100) 刊 名： 西北农业学报 ISTIC PKU 英文刊名： ACTA AGRICULTURAE BOREALI-OCCIDENTALIS SINICA 年，卷(期)： 2005 14(3) 分类号： Q939.13+2 ----------------------------------------------------------------------------------------------- 紫外诱变复合重金属离子抗性突变选育霉酚酸高产菌株 作者：娄忻 贾啸静 刘胜利 张华 【摘要】 以霉酚酸产生菌1321#为出发菌株，采用紫外线诱变并复合重金属Cr6+、Cu2+抗性株筛选，获得一株遗传性状稳定且摇瓶发酵水平提高86.6%的164#高产菌株。经发酵配方优化，该菌株的摇瓶单位再度提升了5.5%，显示出了高产潜力。 【关键词】 霉酚酸； 诱变； 重金属离子； 抗性筛选 ABSTRACT A mycophenoilc acid (MPA) producing strain Penicillium brevicompactum #1321 was treated by UV, followed by resistance selection with heavy metal Cr6+ and Cu2+. A stable strain #164 was obtained with the potency of MPA higher by 86.6% than starting strain in shaking culture. The potency was further improved by 5.5% in the optimized fermentation medium. KEY WORDS Mycophenoilc acid; Mutagenesis; Heavy metal ion; Resistant screening 霉酚酸(mycophenoilc acid，MPA)为短密青霉(Penicillium brevicompactum)产生的抗真菌、抗肿瘤并具免疫抑制作用的抗生素［1］。MPA是次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的可逆性抑制剂，能选择性地抑制淋巴细胞活性，它的2-乙基酯类衍生物——霉酚酸酯(MMF)是新一代免疫抑制剂，在临床器官移植和自身免疫性疾病的治疗方面展示了良好的应用前景。做为合成MMF的前体化合物，提高MPA的工业化水平对于生产企业来说十分重要。 MPA产生菌原始菌株的产量有限，其高产菌株的选育研究近年来渐成热点。张琴等［2］报道采用紫外线及亚硝基胍诱变产生菌，以MPA和三氟乙酸为抗性筛选标记，筛选到了高产突变株；杨亚勇等［3］报道紫外线和亚硝酸复合诱变MPA产生菌的原生质体，经原生质体再生获得了高产菌株。本文报道了应用紫外诱变与定向筛选重金属离子抗性株相结合的方式，进行MPA育种研究，并获得了高产稳定的突变株。 1 材料与方法 1.1 出发菌种 短密青霉(Penicillium brevicompactum)1321#。 1.2 培养基及培养条件 (1)分离及斜面培养 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，26℃培养5d～7d。 (2)种子培养 淀粉10g，葡萄糖5g，酵母粉3g，氯化钠1g，硫酸镁0.5g，碳酸钙1g，自来水1000ml，自然pH。26℃，220r/min摇床，培养2d。 (3)发酵培养 淀粉12g，蔗糖50g，玉米浆50g，鱼粉蛋白胨2g，酵母粉13g，硫酸铵4g，磷酸二氢钾1g，氯化钙2g，碳酸钙0.5g，自来水1000ml，自然pH。26℃，220r/min摇床，培养7d。 1.3 菌种诱变与筛选 (1)紫外照射单因子处理 由出发菌株的成熟斜面制得单孢子悬液置平皿中，紫外灯(30W，波长254nm， 距离40cm)照射4～5min， 孢子液适当稀释后涂布于PDA平板培养基上。培养5d后挑取单菌落进行摇瓶筛选。 (2)紫外照射复合Cr6+、Cu2+平板抗性处理 制备含有0.6%、0.7%和0.8%铬酸钠以及0.02%、0.05%和0.1%硫酸铜的PDA平板，将UV处理过的孢子液适当稀释并涂布于含Cr6+、Cu2+平板培养基上，培养5d～7d后挑选孢子丰富、菌落直径相对较大的抗性菌落进行摇瓶筛选。 1.4 发酵液单位检测 样品处理 定量吸取发酵液，加入1.5倍的无水乙醇，充分振荡1h，3000r/min离心10min。取上清液由HPLC测效价。 HPLC测定 色谱柱Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm)；流动相为甲醇∶0.1%醋酸(70∶30)；检测波长250nm；柱温40℃。 MPA对照品为Sigma公司产品。 2 结果 2.1 菌种诱变系谱 2.2 摇瓶筛选结果 出发菌株1321#经过UV诱变处理结合Cr6+、Cu2+抗性株筛选，最终获得164#高产突变株，其摇瓶产量比1321#提高了86.6%(表1)。 由表1可见，UV+Na2CrO4复合处理筛选到的942#菌株的产量提高幅度最大，随后进行的UV+CuSO4复合处理得到的164#菌株其发酵单位进一步提升。 2.3 高产突变株的菌落形态变化 164#高产突变株的菌落形态与原始菌株1321#相比有了较大变化。1321#为圆形扁平状菌落，而164#的菌落中央凸起，呈对称性放射褶皱状。且有直径变小、孢子量减少的趋势。表1 三种诱变筛选方式获得正变株(系谱菌株)的相对摇瓶产量以出发菌株CK1321#摇瓶产量为100%计。2.4 高产菌株遗传稳定性考察 164#菌株经连续四次斜面传代后与F1代进行摇瓶发酵单位的比较，其子代效价与F1代基本持平。证明该菌株的遗传稳定性良好。 2.5 发酵配方优化 以164#做为试验菌株，对发酵培养基中的淀粉、蔗糖、酵母粉、鱼粉蛋白胨、玉米浆进行U15(155)均匀设计试验。经验证，配方优化后164#菌株的摇瓶单位提高了5.5%。 3 讨论 我公司的MPA产生菌系从土壤中分离得到的野生菌株，经过前期的诱变育种工作，本试验出发菌株1321#的发酵能力已达到产业化水平。为进一步增强产品的市场竞争力，我们面临的任务是选用快速有效的育种手段，短期内将菌种的单位产量大幅提高，以满足生产的需求。 在菌种选育过程中，诱变和筛选方法的选择是十分重要的。Cu2+、Cr6+等重金属离子对微生物有一定毒性［4］，当培养基中的重金属离子达到一定浓度时大多数产生菌的生长被抑制，只有对该金属离子具有抗性的菌株才能生长。抗性的机制可能是由于菌体分泌大量产物或其中间体和有毒的金属离子结合，形成无毒或低毒的复合物以解除对菌体自身的抑制作用［5］，并使之失去终产物的反馈控制。这样就可以从金属离子抗性突变株中筛选到能大量产生目的产物的高产菌株。 我们对1321#菌株采用了包括UV诱变以及UV复合Cr6+、Cu2+抗性筛选的方法，多轮选育后获得164#高产突变株,再经发酵配方优化，其摇瓶产量比出发菌株累计提高92.1%，为生产成本的降低奠定了良好的基础。 【参考文献】 ［1］ 李晓虹，龚炳永，朱宝泉. 微生物来源的免疫抑制剂研究现状［J］. 国外医药抗生素分册，2000，21(6)：271～277. ［2］ 张琴，胡海峰，朱宝泉. 麦考酚酸高产菌株的选育［J］. 中国医药工业杂志，2006，37(7)：452～453. ［3］ 杨亚勇，李长洪，孟文伟. 麦考酚酸产生菌原生质体诱变育种的研究［J］. 中国抗生素杂志，2006，31(10)：587～590. ［4］ 章名春. 工业微生物诱变育种［M］. 北京：科学出版社，1984：206. ［5］ 胡立勇，宋有礼，童村. 杆菌肽产生菌的推理选育［J］. 中国抗生素杂志，1988，13(6)：391～396. [ Last edited by HarveyWang on 2009-10-6 at 11:02 ] |
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