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合肥肽库生物

新虫 (著名写手)

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[交流] 细胞膜穿透肽促进脂质体包载的 siRΝΑ细胞内转运、定位及其功能

摘要 :目的  研究细胞膜穿透性寡肽-八聚精氨酸 (R8)输送包载 siRNA 的脂质体进入细胞能力的促进作用。方法  将合成的 R8与 PEG-PE形成偶联物并定向定量地插入包载 siR NA 脂质体的外层膜上制成 R8-liposomal siR NA。荧光分光光度计测定脂质体中 R8 的含量 ,荧光倒置显微镜观察 R8 修饰的脂质体与常用转染试剂lipofectamine2000携带 siR NA对小细胞肺癌 NCI-H446的转染效果 ,MTT法检测 R8-liposomalsiRNA 对 NCI-H 446细  胞的生长抑制作用。结果  R8未修饰的脂质体不能穿过细胞膜 ,而 R8修饰的脂质体则能迅速进入细胞内 ,随着作用时间的延长逐渐定位在细胞浆和细胞核。R8修饰的脂质体介导 hdm2-siRNA 转染肿瘤细胞的效率和对肿瘤细胞的生长抑制作用明显强于 lipofectamine2000。结论 R8修饰的脂质体可以有效输送 siRNA 进入细胞并增强其生物学功能。
限制生物活性大分子药物有效地发挥临床效果的关键因素之一 ,就是不能穿过生物膜或细胞膜进入靶位与靶分子结合 ,或穿透性极低。生物膜穿透性肽的发现为输送生物活性大分子提供了一个新的有效手段。基于HIV-1病毒TAT蛋白碱性氨基酸区域的TAT49 57的寡肽是一段核定位信号肽且具有似乎不依赖内吞机制迅速穿透生物膜的功能。利用 TAT49 57肽段已成功地将蛋白质、聚合物纳米粒、脂质体等输送到各种类型的细胞内和动物的各个组织器官[1 ~ 4]  。在 TAT49  57寡肽的基础上 ,作者筛选出了比其穿膜能力更强的由 8 ~ 12个精氨酸组成的寡聚体。构建了八聚精氨酸联接的PEG化磷脂自组装胶束 ,并实现了将其定量地插入到包载 hmd2 siRNA的长循环脂质体的脂双层的外层膜上。本文重点研究八聚精氨酸促进siRNA细胞内转运、定位及提高其稳定性和生物活性的输送载体的构建及特性。
材料与方法
药品与试剂  蛋黄磷脂 (ePC ) 、胆固醇 (Ch) 、二硬脂酰乙醇胺聚乙二醇 2 000(PEG2 000 -DSPE) 、二  棕榈酰乙醇胺 ( DPPE ) 、二油酰三甲胺丙烷  (DO TAP)和罗丹明标记的二油酰乙醇胺 (Rho-PE)  购自美国 AvantiPolarLipids公司 ;三乙胺、CL-4B琼  脂糖和聚乙二醇 3 400二对硝基苯碳酸酯 ( PNP2 - PEG3 400 )均购自美国 Sigma公司 ;21 bpsiRNA 由上  海基因药物公司 (ShanghaiGenePharma Co.)合成 ,  有义链为 5/-GACUCGCAAC ACGC UAUUCTT-3/,并  于 3/端进行荧光素 (FITC )标记 ,反义链为 5/- GAAUAGC GUGUUGC GAGUC TT-3/; 八聚精氨酸(R8);基因转染试剂 lipofectamine 2000(Invitrogen,USA );RPM I 1640培养基 (Gibco,  美国 );优质胎牛血清 (北京圣玛元亨生物有限公  司 );其他试剂均为分析纯。
细胞模型  小细胞肺癌 NCI-H 446 购自美国  ATCC 细胞库。细胞均在含 10% 胎牛血清的 RPM I 1640培养基中于 37 节 ,5%  CO2 的培养箱条件下连  续培养。实验细胞为处于对数生长期的细胞。
仪器  zetasizer5000 (Malvern InstrumentsLtd) 激光衍射粒度分析仪 ;数码荧光倒置显微镜(Olympus1XT1和 Nikon D1数码像机 ,日本 );JEO L 透射电子显微镜 (日本 )。
pΝP-PΕG-DPPΕ 的合成[5]    取 20 mg.  mL-1 DPPE氯仿溶液 10 mL,置 50 mL圆底烧瓶中 ,滴加三乙胺 (TEA )  0.65  mL,将 ( PNP)2 -PEG3 400 (200 mg. mL-1氯仿溶液 )约 4.0 g加入上述混合液中 , 吹入氮气 ,密封 ,避光 ,于室温下 ,磁力搅拌过夜。减压蒸干溶剂 ,真空除尽残留氯仿 ,加入 0.01 mol. L-1 HCl水溶液 100 mL,超声处理形成透明的胶束溶液。0.01 mol.  L-1 HCl水溶液为洗脱液经 CL-4B Sepharose进行分离 ,除去未反应的 (PNP)2 -PEG3 400和释放的 PNP,收集含 PNP-PEG-DPPE 胶束的洗脱液 ,冷冻干燥 ,用 TLC , HPLC,MS 和 NMR 对 PNP- PEG-DPPE进行定性和定量检查。
R8-PΕG-DPPΕ 的合成[5]       取 PNP-PEG-DPPE  100 mg溶于氯仿 10 mL中 ,置 50 mL茄形烧瓶中 ,  于旋转蒸发仪上减压除去氯仿 ,形成脂膜 ,真空除尽  残留氯仿 ,将 R8  25  mg溶于 0.01  mol.  L-1  HCl 4 mL中 ,加入内壁涂布脂膜的茄形烧瓶中 ,于室温  孵育 30 min,轻摇使脂膜充分分散。于混悬液中加  10 mmol. L-1 (pH 9.0) Tris缓冲液 20 mL,混匀 ,氮气保护 ,于 4 节孵育过夜。将样品置分子质量为 5  kD的透析袋中 ,在 10 mmol.  L-1  (pH  7.4) Tris缓  冲液中透析约 4 h,再用去离子水于 4 节透析 24 h,  取出袋内溶液 ,冷冻干燥 ,置 -20 节冰箱内保存。
脂质体的制备[5]    将 ePC ,Ch, PEG2 000 -DSPE 和 DO TAP的氯仿溶液按摩尔比 (60:34:3.0:3.0)  混合 ,如需标记脂膜 ,于上述混合液中加入占总脂质量摩尔比为 0.1% Rho-PE,减压除尽氯仿 ,形成脂膜。将一定量的 siR NA溶于经 DEPC 处理的超纯水中 ,siR NA 用量应完全中和 DO TAP所带的正电荷。于 50 节水浴中 ,用含 siR NA 的水溶液将上述磷脂膜水化 30 min形成包裹 siR NA 的脂质体。用手动挤出装置 (AvantiPolarLipids)将初步形成的脂质体分别过 0.4μm 和 0.1 μm 的聚碳酸酯核孔膜 (Whatman) 10次 ,制备粒径均一的脂质体。适量 R8-PEG-DPPE溶于甲醇中 ,置圆底烧瓶 ,氮气吹干成膜 ,加入制备好的脂质体混悬液 ,于 37 节水浴中 , 温浴 2 h使 R8-PEG-DPPE 定向地插入到脂质体的外层膜上。其中八聚精氨酸在脂质体中占总脂质成
分的摩尔比一般为 0.5%  ~ 1.0% ,根据实验需要可适当调整其比例。用动态激光散射、冰冻蚀刻电子显微镜、核酸电泳来检验八聚精氨酸修饰的包载 siR NA的聚乙二醇修饰的脂质体的理化特性。
胶束和脂质体中八聚精氨酸的定量测定[6]
精密称定 R8和 R8与 PEG2DPPE 的偶联物溶于或分散于纯水中使 R8的质量浓度范围为 5 ~ 50 μg. mL-1 。取样品 20 μL置 25 mL量瓶中 ,加入 2 μg. mL-1 9,102菲醌荧光衍生化试剂 (9,102菲醌溶于二甲基甲酰胺 ,新鲜配制 ,4 节可保存 1周 ) 2.5 mL和 1 mol.  L-1 NaOH 溶液 0.25 mL,室温放置 45 min, 加入 1 mol.  L-1 HCl溶液 0.25 mL,用水定容至刻度 ,样品进行荧光扫描。按上述方法将 R8修饰的脂质体 (R82liposomes)与 9,102菲醌荧光衍生试剂反应后进行荧光扫描。
八聚精氨酸介导的脂质体细胞内转运和分布
NCI2H 446细胞按每孔细胞数为 8.0 x 103接种 96孔板中 ,培养过夜 ,洗去培养基 ,分别加入5 μL的下列样品 :Rho2PE 标记的 R82liposomes, Rho2PE 标记的 liposomes,R8修饰的包载 FITC 标记的 siR NA 脂质体 (R82liposomal FITC2siR NA ), lipofectamine 20002 FITC2siR NA 复合物 (lipofectamine 20002FITC2siR NA  complex),每一样品 3复孔。除 lipofectamine 20002 FITC2siR NA complex加入不含血清的培养基外 ,每孔中加入含 10% 胎牛血清的培养基 100  μL,再于 37 节 ,5%  CO2的培养箱中继续培养 1,3,6和 24 h。于各设定的时间点取出细胞 ,用灭菌 PBS溶液洗 3 遍 ,置荧光倒置显微镜下观察细胞并用 Nikon D1数码相机拍摄照片。
细胞生长抑制实验  NCI2H 446细胞按每孔细胞数为 8.0 x 103接种 96孔板中 ,培养过夜 ,洗去培养基 ,分别加入不同脂质浓度的下列样品各 5 μL: R82liposomes和 lipofectamine 2000以及不同 siRNA浓度的列样品各5μ L: R82liposomal siRNA, lipofectamine 20002siR NA, lipofectamine 20002siR NA complex,每一样品 3 复孔。除 lipofectamine 20002 siR NA complex加入不含血清的培养基外 ,每孔中加入含 10% 胎牛血清的培养基 100 μL,于 37 节 ,5%  CO2的培养箱中继续培养 24 和 48  h。于各设定时间点取出细胞 ,每孔加入 MTT 20 μL(5 mg. mL-1 ), 再培养 4 h,每孔加入 DM SO 150 μL溶解 ,置于酶标仪 ,在 590 nm处检测其最大吸收 ,绘制各浓度组的生长曲线。
结果
1 R8与pΝP2PΕG 2DPPΕ偶联物的合成
当溶液的 pH> 8时 ,PNP2PEG2DPPE 与 R8的氨基末端反应形成稳定的氨甲酸酯键 ,同时释放出游离的对硝基苯。PEG2DPPE在水中自动形成 10 ~  15 nm 胶束 ,由于它是双亲性分子 ,当 R8与 PEG2 DPPE形成偶联物后 ,增加了 R82PEG2DPPE 分子中亲水端的相对分子质量使其形成的胶束的水化半径更大。因此 ,PEG2DPPE偶联 R8后 ,在分子筛柱上的保留行为发生较大的变化 (图 1)。PNP2PEG2 DPPE和 R82PEG2DPPE在 HPLC 分子筛柱上的保留时间分别为 9.0 min(图 1A)和 7.8 min(图 1B)。当 R8与 PNP2PEG2DPPE在 4节反应24h后 ,样品直接进行 HPLC 检测 ,在色谱图中得到保留时间分别为 9.0 min和 7.8 min的两个峰 (图 1C ),说明 R8与 PNP2PEG2DPPE发生了偶联。反应混合物置于相对分子质量为 5 000的透析袋中 ,分别在 Tris缓冲液和水中经一定时间的透析 (24 h)可以将未结合的 R8,PEG2DPPE和释放的 PNP完全除去 (图 1B)。
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2 胶束和脂质体中八聚精氨酸的含量
为了定量地评价 R8介导的脂质体细胞内输送能力 ,建立精确地测定插入到脂质体外层膜上R8的含量是十分必要的。由于R8本身不具有发色基团 ,不能用一般的光谱方法直接检测。利用 R8分子中的胍基能专属性地与一些有机化合物的基团反应产生荧光的性质 ,将 R8在碱性条件下与 9,10-菲醌反应产生具有荧光的 R8-菲醌偶合物。R8, R8- PEG-DPPE与 9,10-菲醌反应后 ,产物分别进行荧光扫描 ,结果见图 2A 和图 2B。R8,R8-PEG-DPPE 与 9,10-菲醌反应后产物具有相同的激发波长和发射波长 ,二者均为 260  nm 和 405 nm 。然而 ,R8-PEG- DPPE所产生的荧光强度比 R8产生的荧光强度稍强。未经 R8修饰的脂质体与 9,10-菲醌反应不产生荧光 (图 2C ),这一结果提示 R8脂质体中脂质成分并不影响 R8的测定。以 R8-PEG-DPPE 的浓度对荧光强度回归 ,得标准曲线 :F = 363.570C(μg.mL-1 ) - 15.493, = 0.999 8。线性范围 0.2 ~ 20μg. mL-1 。样品测定的激发波长为 260 nm和发射波长为 405 nm。R8-liposomalsiRNA 经十二烷基磺酸钠 (SDS)裂解并与 9,10-菲醌反应后测定其荧光强度 ,代入标准曲线计算脂质体中 R8-PEG-DPPE 的含量。脂质体中 R8的摩尔分数为 0.52% 。由于已知脂质体中 R8 和磷脂的用量 ,对于一个给定粒径的单室脂质体 ,即可以定量计算每个脂质体上所携带 R8的数量[7] 。本文所用脂质体的粒径为 150 nm,每个脂质体上所携带 R8的分子数量约为 300 ~  500个。
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3 脂质体的特性
为了克服核酸类药物在体内应用时普遍存在的易被核酸酶迅速降解而导致的不稳定性和半衰期短、不能透过细胞膜和组织分布的非特异性等问题 , 本研究设计了基于以下3个功能的基因药物转导载体 :电荷中和及其诱导的自组装、PEG 分子形成的保护外壳和暴露于脂质体外层表面的细胞膜穿透肽，动态散射光测定结果明 , liposomal-siRNA和R8-liposomalsiRNA粒径分布窄而均一 ,平均粒径分别为 133 nm和 138 nm, liposomal-siR NA 经 R8修饰后平均粒径增大了约 5 nm 。冰冻蚀刻电子显微镜照片显示 , R8-liposomal siRNA 的外形构造类似SARS病毒 ,其大小在 50 ~ 200  nm,由数个15 ~ 30 nm的小颗粒组装而成 (图 3A )。凝胶电泳显示 , siR NA 的双链不能被溴化乙锭染色 ,表面活性剂十二烷基磺酸钠处理后 ,siRNA 被释放出来并能被溴化乙锭染成明亮的条带 (紫外灯下 ),其条带在凝胶上的位置与游离 siR NA 的条带一致 (图 3B) 。另外 ,脂质体包裹的 siR NA 在血清中的稳定性显著增加 ,与血清共温育 24 h后未见分解。相反,游离的 siR NA在 6 h内被完全分解。
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4 体外细胞摄取
4. 1 R8促进脂质体细胞内转运及其胞浆的累积小细胞肺癌 NCI-H446细胞分别用罗丹明标记的R8修饰的脂质体或罗丹明标记的 R8未修饰的脂质体处理不同时间 ,结果见图4。脂质体经 R8修饰后显著地促进了脂质体向细胞内转运。1h后 ,在细胞内可观察到明显的荧光 ,随着作用时间延长 (3 ~ 6 h),胞浆内的荧光强度增高并逐渐向核内转运。未经R8修饰的脂质体则不能进入细胞 ,甚至细胞被处理24h,也未观察到荧光。R8介导的脂质体细胞内转运存在明显的温度依赖性 ,当用罗丹明来标记的R8修饰的脂质体在4ε处理细胞不同时间 ,仅在胞膜上观察到荧光 ,延长孵育时间胞膜上的荧光增强。上述结果说明 ,R8可促进脂质体细胞内转运和在胞浆的累积。
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4. 2 R8介导脂质体包裹的hdm2 -siRΝΑ转染肿瘤细胞荧光标记 siRNA并将其包裹于R8修饰的脂质体中 ,考察 R8输送 siR NA 穿过细胞膜进入细胞  的能力。小细胞肺癌 NCI-H446细胞分别用 R8-liposomal FITC-siR NA 和 lipofectamine 2000-FITC- siRNA complex处理不同时间 ,结果见图5。R8-liposomalFITC-siR NA在 10% 血清存在的培养基中  其转染细胞的能力比 lipofectamine2000-FITC-siRNAcomplex在无血清的培养基中的转染能力强 (比较经二者处理的细胞内的荧光强度 )。Lipofectamine 2000-FITC-siRNAcomplex在有血清的培养基中不  能转染细胞或转染率极低。实验结果说明 ,血清的存在不影响 R8介导转染效率。
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5 Ηdm2-siRΝΑ细胞毒作用
P53显著促进肿瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤的生长是肿瘤生成的抑制基因。大多数人肿瘤细胞高表达 HDM2 蛋白 ,HDM2 蛋白的高表达加速细胞内 P53的降解和抑制 P53的活性 ,促进了肿瘤的生成和生长。因此 ,P53及其相关调控基因可作为抗肿瘤药物设计和开发的新靶标。根据 RNAi理论 ,作者设计合成了选择性地降解 hdm2 mRNA 的 siR NA片段。肿瘤细胞生长抑制实验表明 , R8-liposomal siR NA在 10%血清存在的培养基中其抑制肿瘤细  胞生长的能力比 lipofectamine 2000-siR NA  complex 在无血清的培养基中的抑制效果稍强 ,抑制百分率分别为71.5%和57%(图 6)。Lipofectamine2000- siRNA complex在有血清的培养基中不能有效抑制细胞的生长 ,故在实验中采用常用的无血清转染。
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讨论
近年来 ,小分子干扰 RNA (siR NA )能高效且特异地阻断内源性同源基因的表达即 RNA 干涉 (RNAi)现象的发现 ,一方面拓展了 RNA 在基因表达调控中生物学功能的认识 ;另一方面 ,作为一种简便而又高效特异的抑制靶基因表达的新技术 ,RNA干涉在新基因的功能研究以及抗病毒和抗肿瘤治疗新措施的探索中也广为应用[8-10]。与反义核酸相比 ,siRNA具有选择性强、毒性低的优点 ,这是因为 siR NA只高度特异性地降解同源性靶标 mRNA,不影响其他基因 mRNA 的表达或影响较小。另外 ,两者作用于靶基因的不同周期和靶基因在细胞内的不同位置 ,反义核酸是在核内与前体 mRNA 结合而发挥作用 ,siRNA则是在胞浆内与成熟的 mRNA 结合而使其降解。由于 siR NA 的作用靶点必须定位于胞浆 ,而且 , siR NA 与其他用于基因治疗的核酸类药物一样 (DNA 和 RNA )普遍存在着体内稳定性差、生物利用度低和不能穿过由脂双层构筑的细胞膜等问题。因此 ,有效地将核酸类基因药物输送到靶组织细胞内是了解核酸类基因药物作用机制和生物学功能的关键 ,基因药物输送载体的研究成为基因治疗中研究的重点。为解决上述问题 ,作者成功地构建了基于长循环脂质体的细胞膜穿透性肽修饰的非病毒的基因或基因药物的转导载体。小细胞肺癌细胞株体外转染试验显示八聚精氨酸修饰的脂质体介导 hdm2-siRNA的转染效率显著高于目前广泛使用的基因转染试剂lipofectamine 2000,而毒性明显低于 lipofectamine 2000,并实现了靶基因的沉默和对细胞生长的抑制作用。
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