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重组蛋白上已经有巯基了，可以直接加入SMCC活化的荧光染料进行交联吗？ 已有1人参与
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大家好，我是流式荧光崔工，一个旨在链接与流式荧光相关的朋友，一起赚钱、一起学习、一起工作、一起生活的靓仔。 上一篇文章制作PE-Cy7串联染料时，Cy7是和PE上的什么基团连接的？ 回到了一位老师购买崔工家染料时咨询的问题。 大家刚开始接触PE时，可能都会有这样的误解。 PE上的氨基都已经跟Cy7反应了，SMCC还怎么跟PE上的氨基连接呢。 答案就是PE上的氨基太多了，有70多个，Cy7只有部分跟PE反应了而已，剩下的是可以再和SMCC反应的。 今天有位老师找崔工聊天。 老师问：崔工你们有做过重组蛋白的荧光标记嘛？ 这个问题有点大，问的崔工都不知道怎么回答，回答做过，重组蛋白那么多，染料也那么多，万一老师问的刚好是我们没有做过的就尴尬了。 如果回答没有做过，但我们又帮客户标记过。 所以崔工只能反问到，你具体指的是给重组蛋白标记什么荧光染料呢？ 老师说：我们想给重组蛋白标记PE、APC等染料。之前有试过用这些染料去标记多肽，但是效果不是很好，交联效率很低，去做流式检测时基本上都是阴性的。 崔工问，你的多肽或者蛋白有氨基或者赖氨酸残基没？ 只要你的多肽或者蛋白有氨基或者赖氨酸残基中的一个就可以标记的。 老师听后疑惑的问道：PE或者APC不是和SMCC反应之后就和巯基反应么？这样多肽或者蛋白上是要有巯基啊，怎么会需要氨基或者巯基呢？ 崔工说，是的，我们常用的方法是用DPDP跟抗体、蛋白、多肽上是氨基反应产生二硫键，再用TCEP去切除产生巯基，巯基与SMCC反应，最后让抗体、蛋白、多肽带上荧光。 当然也有老师是直接用DTT去打开抗体的二硫键的方法。 崔工在以前的文章中讲过，不建议这样做，不清楚的可以翻看前面的文章，也可以联系崔工问我。 老师你说的多肽上已经有巯基了，用SMCC活化的染料去交联后上流式却没有荧光。 你需要了解下，这里有几个问题。 第一巯基最少要5-6个，只有有多个巯基才行。 第二，你得到重组含有巯基的蛋白需要快速交联，否则巯基之间是很容易形成二硫键的，这样你肯定交联不上。 你确定这个没有问题的话，最后肯定是有信号的。 如果不确定的话，最好还是用SPDP的方法。 今天的文章就分享到这，如果今天的文章对您有一点点帮忙或一丝丝的启发，欢迎帮忙点个在看和转发，也可加崔工微信进一步交流沟通。 |
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