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所谓qPCR阳性对照，是必须的吗？
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| 我的实验是观察不同浓度生长因子A在不同时间点对培养细胞B中的基因C表达的影响。qPCR结果出来后，老板说不可信，因为缺乏阳性对照，有点糊涂，好像并不是所有qPCR 都必设阳性对照啊？就我实验而言，是否应找到已经证实了的，在A刺激下必然在B中表达的基因D做对照呢？扩增时是否像内参一样与目的基因标本一对一的加入96孔板中？这个基因D很难确定啊，我的A因子是不同浓度，不同时间点，怎么确定它每个浓度时间点下都稳定表达呢？请高手指点一二，不胜感激。 |
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HarveyWang
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STRATAGENE荧光实时定量PCR说明书的学习笔记 (2008-11-10 13:12:51)标签：引物 定量pcr 探针 ct 分类：学习笔记 影响基因表达实验的主要因素：样品间的生物差异，所用技术的差异。最好使用多重水平对照。 REAL-TIME PCR常用的对照样品 1 阳性对照可以帮助辨别由于模板质量、PCR抑制剂等因素导致的假阴性反应，特别是对多种类的混合样品。可以为完全不同的外源性样品，或为内源性阳性对照，由同样的核苷酸样品扩增为不同的目标产物。 外源性阳性对照是一个包含感兴趣目标产物的模板，但与你的实验样品无关。如包含感兴趣基因的质粒，体外RNA逆转录产物，以前的PCR产物，人或鼠的QPCR对照总RNA，从已知包含或表达感兴趣目标产物的组织中分离的DNA或RNA。阳性对照可以鉴定扩增反应是否有进行，荧光信号是否产生及其监测是否正常。但不能说明你的欲测样品是否存在PCR抑制剂，一些样品中是否有核苷酸降解发生。 内源性阳性对照指从同一个模板中扩增另一个产品，可以在同个或分开的反应管中进行。也就是使用对照基因。可以帮助监测缓冲液、聚合酶中可能出现的问题。但由于使用不同的引物和探针，所以无法判断引物和探针来源的问题。 阳性对照只能说明扩增反应是否发生，但无法检测由于RT或PCR抑制剂导致的CT值增大，而不妨碍扩增。另一种外源性阳性对照stratagene's alien QRT-PCR inhibitor alert target RNA. 用阳性对照作标准曲线，如包含靶序列的质粒、纯化的PCR产物、合成的单核苷酸、stratagene's QPCR人或鼠参照总RNA，可对未知样品进行绝对定量。标准曲线也可用来计算扩增效率，如果效率降低或线性下降，说明试剂存在问题或有抑制剂污染发生。 2 阴性对照如呈现假阳性，原因为污染，非特异性PCR产品形成，非特异性探针降解。而是否会影响CT值的可靠性则取决于阴性对照孔中的信号水平。如果阴性孔中的CT值比任何样品孔都高10个循环，可以认为这些结果是准确的。如果小于5个，结果就非常值得怀疑了。常用阴性对照有NTC（no template controls),NAC(no amplification controls),NPCs(no probe controls),NO RT(no reverse transciptase controls)。NTC没有模板，可用来监测外源性污染或其它非特异性荧光信号增加因素。NTC样品孔不应检测到信号放大，如果超出了阈值，它的CT值与最低浓度样品的CT值应至少相差5个，最好多于10个。例如最低浓度样品CT为25，NTC则至少为30以上。 NO RT没有逆转录酶，可用来监测DNA污染。NAC无DNA聚合酶，可监测探针是否降解，导致荧光增强，而非实际扩增。NPCs无探针，可检测背景荧光信号（可能源自污染）。 3 被动参照染料：与任何扩增反应无关，在整个扩增反应中荧光保持恒定。由于每孔中所加的染料浓度和体积相等，理论上每孔的荧光强度一致。参照染料可以起到校正作用，在每个循环中，用每孔感兴趣染料的原始荧光强度除以同孔的参照染料荧光强度，可以消除因孔板的透明度和反射，加样体积带来的误差。校正的数据为Rn或dRn。最常用的参照染料是ROX，在体系中的终浓度为30nM。 使基因表达标准化的方法 1 逆转录反应的差异性：为使逆转录反应的潜在差异最小化，可平行反应三孔，在QPCR前将产物合并，即使个别反应效率有差异，也不会影响最终结果。如要检测RT效率，可将一种外源性RNA Alien QRT-PCR inhibitor alert等量加入到每孔，检测每孔产物的数量是否一致，以判断RT效率是否有区别。 2 运用对照基因标准化样品：消除样品间差异的最佳方法是使用对照基因，尤其是相对定量。标准化基因是一种典型的看家基因（housekeeping gene），最常用的是GAPDH和 β-actin。由于对照基因的表达水平是恒定的，其CT数值的任何变动都可能是由于RT反应效率、RNA纯度、RNA量的差异。对照基因均被视作内源性基因，理想的对照基因在每个样品中的CT值应是相等的，正负0.5的差别说明对照基因的表达量有2倍差别。如果不计成本，可同时采用三种对照基因。 方法优化 可首先优化引物浓度，然后探针浓度（如果使用探针），镁离子浓度。如果要使用昂贵的探针，可以在购买探针前先用SYBR来检测引物是否可用。引物浓度和探针浓度的优化原则是得到最高的dRn值和最低的Ct值。 熔解曲线分析：在熔解曲线分析中，所有扩增产物在95度熔解，55度复性，再逐步升温。熔解曲线分析最好是用荧光值Rn对温度作图，如没有用参照染料，则用R对T作图。在曲线上每个峰代表一个熔解的特异性产物。大部分QPCR产物会在80-90度范围内熔解，但由于大小和序列的差异，Tm会有偏差。理想情况下应该只有一个单峰在此温度范围内出现，同一个样品在所有扩增反应中的产物的熔解温度是一致的。如果出现第二个峰或肩峰，而NTC孔也有同样的第二个峰，则为引物二聚体形成或在反应中同时扩增的其它序列污染。由于引物二聚体会有一个典型的低熔解温度，slight,high cycle amplification和一个小宽峰出现在低熔解温度说明只有引物扩增。很容易区别引物二聚体的峰和扩增子污染形成的峰。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物可以判断多个Tm的出现是多个产物形成，还是SYBR染料结合的产物。如在NTC孔里检测到少量引物二聚体是可以接受的，但如果样品扩增曲线中有一个相应的峰，则这些孔的CT值就不可信。此时有必要重新设计引物。如果NTC孔无第二个峰，可能是非特异性引物结合或者是differentially spliced products形成。在引物设计完后运行一个BLAST搜索可以降低这种问题的机率。 |
2楼2009-10-03 03:37:43
