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linxi8579铜虫 (正式写手)
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求助：EB配置方法
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我们实验提RNA要用EB染，但是干粉配置的浓度不知道，急切的请教各位老师了？！ [ Last edited by 350784478 on 2009-9-30 at 10:46 ] |
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3楼2009-09-29 18:39:50
wjswj
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2楼2009-09-29 11:48:42
HarveyWang
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转来的，可供参考。 -------------------------------------- Ethidium Bromide Concentrations to be used: stock solution: 10 mg/ml working concentration: 0.5 ug/ml for staining solution (not necessay to be EXACTLY. Destain will get better resolution of image. You do not need to do so if you do not need great image. working concentration: 0.3 ug/ml for gels ------------------------------------------------------ ---我们就是在配胶，溶胶在胶有80度左右的时候，加入eb大约是5微升。效果不错（在100毫升中） -------我们是在配胶时，在倒胶之前大概60多度的样子加到胶里头，混匀再倒胶。 ---------减少污染起见，应该后染。0.5ug/ml 7MIN不用脱色 推荐！！ -------我们是配胶时加EB， -------我们楼上是跑完胶放EB里泡10分钟左右，浓度不用太大，也没有脱色 ------如果是聚丙烯酰胺胶还是跑完再染EB的好 琼脂糖胶溶解后稍冷却灌胶前点一点就行了 ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较 【摘要】 目的 使用染胶法、染样品法及后染法比较溴化乙锭（EB）与3种新型核酸染料GoldViewna II、GoldView及DNA Green染色DNA的灵敏度。 方法 在琼脂糖凝胶电泳中，分别在3种染色方式下使用4种核酸染料对凝胶中的DNA进行染色，观察并分析电泳结果。 结果 核酸染料比较结果：GoldViewna II的灵敏度最高，DNA Green的灵敏度与EB相当，GoldView的灵敏度略低于EB。染色方式比较结果：使用染胶法的灵敏度最高，后染法次之，染样品法最低。结论 三种新型核酸染料完全可以替代EB，用于琼脂糖凝胶电泳DNA染色。使用新型核酸染料建议采用染胶法染色DNA。 【关键词】 琼脂糖凝胶电泳 核酸染料 溴化乙锭 Abstract：Objective To compare the sensitivity of ethidium bromide(EB)and three types of new nucleic acid dye:GoldViewna II,GoldView and DNA Green staining DNA by three staining methods:prestaining gel method,prestaining sample method and poststaining method.Methods Four nucleic acid dyes were used to stain DNA respectively by three staining menthods in agarose gel electrophoresis and the results were observed and analyzed.Results The comparative result of nucleic acid dye:the sensitivity of GoldViewna II is highest of all;the sensitivities of DNA Green and EB are in the same degree;the sensitivity of GoldView is less than EB.The comparative result of staining method:The sensitivity of staining DNA by prestaining gel method is highest of the three and poststaining method is higher than prestaining sample method.Conclusion These three types of new nucleic acid dye can substitute for EB as a general dye to stain DNA in agarose gel electrophoresis.It is recommended to use Prestaining gel method when using new type of nucleic acid dye. Key words:agarose gel electhophoresis; nucleic acid dye; Ethidium bromide 溴化乙锭（EB）曾是琼脂糖凝胶电泳中使用最为普遍的核酸染料，被广泛应用于观察、检测核酸，具有操作简单、快速及灵敏度高等特点［1］。但作为一种强诱变剂，EB具有高致癌性。废弃的EB染液易污染环境，必须进行净化处理，给实验研究人员带来诸多不便［1］。 近年来陆续推出了多种新型核酸染料，比如GoldViewna II，GoldView，DNA Green等。这些核酸染料的灵敏度是否高于EB，能否替代EB广泛用于DNA的染色是人们关心的问题。 有研究显示EB染色DNA使用后染法比较好［2］。那么，新型核酸染料使用染胶法、后染法还是染样品法的检测灵敏度最高，最实用呢？ 本文在3种染色方式下分别使用4种核酸染料对凝胶中的DNA进行染色。在3种染色方式下比较4种核酸染料的灵敏度，为相关实验中选择合适的核酸染料和染色方法提供参考。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 电泳级琼脂糖购自西班牙BIOSCIENCE公司。分子量标准DL15 000＋2 000购自Takara公司。EB为Sigma公司产品，工作浓度为0.5 μg/ml。GoldViewna II型核酸染料（5 000×）购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，工作浓度为1×.GoldView（20 000×）为北京赛百盛基因技术有限公司产品，工作浓度为1×；DNA Green（10 000×）为天泽基因工程有限公司产品，染胶与染样品的工作浓度为1×，后染的工作浓度为10×；其余试剂均为国产分析纯。 1.2 主要仪器 Bio-Rad电泳系统及凝胶成像系统。 1.3 方法 1.3.1 染胶法 同时制备四块1％琼脂糖凝胶。在凝胶凝固前，分别加入4种染料。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽中。于不同泳道中分别加入0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000.使用5V/cm的电压进行电泳，最后用凝胶成像系统观察拍照。 1.3.2 染样品法 同时制备四块不加染料的1％琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽中。将分别将0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000与4种染料混合，避光10 min.然后于不同泳道中加入。使用5V/cm的电压进行电泳，最后用凝胶成像系统观察拍照。 1.3.3 后染法 同时制备四块不加染料的1％琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽中。于不同泳道中分别加入0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000.使用5V/cm的电压进行电泳。电泳后将凝胶分别浸入用1×TAE稀释的4种不同染液中。按照说明书要求，GoldViewna II、GoldView、DNA Green及EB避光染色的时间分别为60 min、30 min、30 min、30 min.DNA Green染色完毕后还需用1×TAE脱色30 min.最后用凝胶成像系统观察拍照。 2 结果与分析 2.1 染胶法 染胶法的结果（图1）表明四种染料使用该法的灵敏度均最高，其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为0.5 ng；EB能检测到的DNA含量约为1 ng；GoldView与DNA Green能检测到的DNA含量约为2 ng. 2.2 后染法 后染法的结果（图2）表明四种染料使用该法的灵敏度低于染胶法。其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为1ng；EB能检测到的DNA含量约为2 ng；DNA Green与GoldView能检测到的DNA含量约为5 ng.图2 使用后染法比较4种核酸染料染色DNA的灵敏度 2.3 染样品法 染样品法的结果（图3）表明四种染料使用该法的灵敏度最低。其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为2 ng；EB与DNA Green能检测到的DNA含量约为5 ng、GoldView能检测到的DNA含量约为10 ng. 3 讨论 GoldViewna II是国内近年来推出的新型核酸染料，与SYBR Green I同属花青类染料。SYBR Green I是几年前推出的一种高灵敏度［3］且不具有强致突变性［4］的核酸染料，但由于其高昂的价格限制了它的广泛使用。上述实验表明GoldViewna II的灵敏度高，同时具有花青类染料不具强致突变性的优点，价格也比SYBR Green I便宜数倍。虽然其稳定性不如EB［3］且反复冻融效果变差，但只需要-20℃避光保存和分装使用即可。 DNA Green是国内最近才推出的新型核酸染料。它的灵敏度与EB相当但背景略高于EB，但该染料的价格比GoldViewna II还便宜且稳定性比较好，4℃避光保存即可。 GoldView是国内较早使用的新型核酸染料，它的灵敏度比EB略低且背景太高。不适合做微量的DNA检测。但该染料稳定性也比较好，4℃避光保存即可，价格是这三种染料中最便宜的。 这些新型核酸染料均可替代EB广泛使用，从而减少大量使用EB对人体的危害和对环境的污染。使用者可以根据自己的需要选择合适的染料。 染色方法比较可以看出：染胶法的检测灵敏度最高；后染法的检测灵敏次之；染样品法的检测灵敏度最低，不适合做微量DNA检测。此外，后染法用于新型核酸染料很不合适。花青类染料用于后染法需要将染料用1×的电泳缓冲液稀释到聚丙烯容器中，在避光条件下该溶液最多可以在24小时内被使用且染2～3块凝胶后其灵敏度会降低，结果略。这样的结果导致染料的巨大消耗，成本太高。DNA Green用于后染的工作浓度为10×，也就是染料用量提高10倍即成本增加10倍，而且在染色半小时后，由于其高背景还需要脱色半小时，延长了实验时间。既往有研究推荐使用后染法的原因是染色的DNA带型平直不扭曲［2］。我们的实践经验得出，电泳时控制合适的电压和上样量，新型核酸染料使用染胶法也能达到同样效果。故使用新型核酸染料染色DNA时推荐采用染胶法。 【参考文献】 ［1］Lunn G, Sansone EB.Ethidium bromide:destruction and decontamination of solutions［J］.Anal Biochem,1987,162 (2):453-458. ［2］王林果,蒋玲艳.2种核酸染色方法的比较［J］.生物技术通讯,2006,11(17):924-926. ［3］Karlsen F, Steen HB, Nesland JM.SYBR green I DNA staining increases the detection sensitivity of viruses by polymerase chain reaction［J］.J Virol Methods,2002,55(1):153-156. ［4］Singer VL, Lawlor TE,Yue S.Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay(Ames test)［J］.Mutat Res,2002,439(1):37-47. [ Last edited by HarveyWang on 2009-10-2 at 10:10 ] |
5楼2009-10-02 09:54:58
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