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行为学实验|大小鼠抑郁模型评价方法
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抑郁症是一种情感性精神障碍，以显著而持久的心境低落、快感缺失、绝望感和无价值感为主要特征，并伴有植物神经功能紊乱的综合征。世界卫生组织的统计数据表明抑郁症的全球发病率达10%～15%，抑郁症的高自杀和自残率严重危害患者的身心健康、工作学习生活及社会交往，同时产生极大的社会经济负担。抑郁症正成为继心脑血管疾病之后导致人类死亡和致残的第二大类疾病。 大鼠和小鼠抑郁行为检测方法是基于兴趣缺失、心境低落、绝望和无价值感为主要特征而设计的。抑郁行为实验方法主要包括糖水偏爱、新奇环境摄食抑制、新奇物体探索、旷场、强迫游泳、悬尾、获得性无助等。 一、获得性无助实验(learned helplessness test) 1、实验方法： 本实验主要分为模型的建立期和条件性回避反应测试期。 (1) 模型建立期： a：实验当天动物应放入测试箱(A室或B室) 中，适应5min。 b：动物应在电击箱内接受30~ 60个运行周期的循环电击。每个运行周期应包括无信号不可逃避的双室足底电击期和间歇期，电击时间应为3～10s，间歇期时间应为3～10s。电刺激频率宜为5～15Hz，刺激电流强度应为大鼠 0.65～1.80mA，推荐 0.8mA；小鼠0.15～0.6mA，推荐0.25mA。如采用电压，大鼠应为65～70V，小鼠30～36V。 (2)条件性回避反应测试期： a：模型建立结束后第2天应进行条件性回避反应测试。 b：动物放入测试箱(A侧或B侧) 中，适应5min后，进行15～30个运行周期的实验。 c：每个运行周期的总时间应为30s，包括3～10s的条件刺激(灯光/声音) 、3～10s的条件刺激+非条件刺激(电击条件同前)和5～25s间歇期(不给以任何刺激)。 d：重复上述步骤连续2～3d。 2、评价指标 (1) 逃避失败次数(times of evasion failures)：动物在设定的非条件刺激持续时间内未完成回避反应的总次数；逃避失败次数与动物的抑郁程度成正比。 抑郁行为判断标准：30次电击，动物逃避失败次数大于25次或者与对照组相比具有显著性增加(P＜0.05) 。 (2) 逃避潜伏期(escape latency)：实验开始后，动物第1次穿梭至对侧测试箱的时间；逃避潜伏期与动物的抑郁程度成正比。抑郁行为判断标准：逃避潜伏期大于15s或者与对照组相比具有显著性增加(P＜0.05) 。 (3) 其他：主动回避次数、安全区时间(无电区域) 、运动总时间(实验期间动物处于运动状态的时间)、运动总路程(实验期间动物物理位移的总和)等实验指标亦作为抑郁行为辅助评价指标。这些指标值越少，表明动物抑郁程度越重。 二、强迫游泳实验(forced swim test) 1、实验方法 (1) 实验前调节测试箱内水温，水温应为23～25℃。水深应根据动物体重进行调整，动物尾巴与测试箱底面保持一定距离。 (2) 如同时进行多只动物实验，每两只动物间应用不透明挡板隔开。 (3) 大鼠强迫游泳实验，应在实验前1d预游，24h后进行强迫游泳实验。记录5min内动物的不动时间、游泳时间及攀爬时间。 (4) 小鼠强迫游泳实验，应在检测当天进行，小鼠游泳时间应为6min，记录后4min的游泳时间、不动时间及攀爬时间。 2、评价指标 评价指标应采用动物不动、攀爬、游泳三类动作的时间及次数进行判定。 (1) 不动(immobility)：动物在水中停止挣扎，呈漂浮状态，仅有轻微的肢体运动以保持头部浮在水面。不动时间越长表明抑郁程度越重。正常小鼠不动时间在检测时间的40%～80%内；正常大鼠不动时间在检测时间的30%～70%内；抑郁行为判断标准：不动时间与对照组相比显著性增加(P＜0.05) 。 (2) 游泳(swimming)：动物进行流畅、协调的运动，动物四肢始终在水面以下。游泳时间和游泳距离越少，表明抑郁程度越重。 (3) 攀爬(climbing)：动物四肢强有力伸出水面，并沿测试箱壁做剧烈的上下动作。5min检测期内，SD大鼠攀爬时间60～130s。攀爬时间越少，表明动物抑郁程度越重。 MDL近期开展的强迫游泳的视频 三、悬尾实验(tail suspension test) 1、实验方法 悬尾实验多采用小鼠，其操作方法如下： (1) 实验开始前，动物尾部悬吊使小鼠呈倒悬体位，头部应与悬尾箱底面保持一定距离。 (2) 如同时进行多只动物实验时，每两只动物间应用不透明挡板隔开。 (3) 记录检测期动物的不动时间。 (4) 实验时间应为6min，记录后4min内动物的不动时间。 2、评价指标 用不动、运动挣扎二类动作行为的时间进行判定。 (1) 不动：动物停止挣扎，身体保持垂直倒悬状态，静止不动。动物的在悬尾实验中的不动时间越长表明抑郁程度越重。空白对照组c57小鼠不动时间较长，均值多大于100s；空白对照组ICR小鼠不动时间均值多小于 100s；抑郁行为判断标准：不动时间与对照组相比有显著性增加(P＜0.05) 。 (2) 运动挣扎：动物有明显可见的挣扎运动。运动挣扎时间越短，表明抑郁程度越重。 MDL近期开展的悬尾实验的视频 四、糖水偏爱实验(sucrose preference test) 1、实验方法 大、小鼠糖水偏爱实验的操作方法上略有不同，对其分别进行总结如下： (1) 大鼠糖水偏爱实验：训练期：动物应单笼饲养，进行48h的蔗糖饮水训练。前24h给予两瓶1%～2%蔗糖水，后24h，一瓶给予1%～2%蔗糖水，另一瓶给予饮用纯水(中途交换两个水瓶位置) 。大鼠禁食禁水14～ 23h 后，进行糖水偏爱指数的测定：测定1h内大鼠对两瓶水的饮用量(g) 。 (2) 小鼠糖水偏爱实验：操作流程同大鼠。但在48h饮水训练时，应全程给予1%～2%蔗糖 水和饮用水(中途交换两个水瓶位置)。训练期结束后，禁水(不禁食)9～16h，测定8～15h内(中间宜交换两瓶位置1次)小鼠对两瓶水的饮用量(g) 。 2、评价指标 应采用蔗糖偏嗜度(sucrose preference) 作为评价指标，蔗糖偏嗜度(%)=蔗糖水饮用量/(蔗糖水饮用量+饮用水饮用量)×100%。 抑郁行为判断标准：蔗糖偏嗜度低于0.4或者与对照组相比有显著性减低(P＜0.05)。 五、旷场实验(open field test) 1、实验方法 旷场实验操作简单，在用于抑郁行为学评价中，无适期阶段，操作步骤如下： (1) 实验前，动物应适应检测环境30～60min； (2) 动物放入测试箱后，即开始检测，检测时间宜为5～10min； (3) 每次实验时应从同一位置同一方向将动物放入测试箱中央。 2、评价指标 (1)总路程(total distance)：动物在实验记录时间内产生的物理位移累积；(2)速度(speed)：动物在单位时间产生的物理位移。5min内正常动物总路程多为1000～2500cm，速度为3～8cm/s。动物出现抑郁行为时，速度减少；(3)运动总时间(totalmove time)：动物在实验记录时间内的产生物理位移时所需的时间累积。正常动物运动时间多大于检测时间的30%; 抑郁行为判断标准：与对照组相比有显著性减低(P＜0.05)；(4) 站立次数(number of standing)：动物在实验记录时间内的站立总次数。10min检测时间，正常大鼠站立次数20～50次。 10min检测时间，空白对照组小鼠站立次数60～130次; 抑郁行为判断标准：与对照组相比显著减低(P＜0.05) 。 六、新奇事物探索实验(novel objective test) 新奇事物探索实验是一种较新的评价抑郁症的典型症状：兴趣缺失的行为学方法。其主要是研究动物对新奇事物的探索行为，是基于动物先天的寻求新奇的行为，并用此来评价抑郁症模型是否存在兴趣缺失症状的方法，一般情况下抑郁症模型动物在新奇事物实验中的探索行为减少。 1、实验方法 新奇事物探索实验分为适应期和测试期两个阶段，操作步骤如下： (1) 适应期：动物放入自发活动测试箱，适应5min后，取出，放回原笼； (2) 测试期：在同一环境条件下引入一新物体(应放入中心位置)，再将待测动物面壁放入测试箱，开始实验; (3) 检测时间应为10min。 2、评价指标 潜伏期(latency period)：实验开始至动物首次主动探索(接触)物体的时间。如规定检测时间内，动物没有接触新物体，则潜伏期记录为检测时间。正常大鼠潜伏期多在130s以内。抑郁行为判断标准：与对照组相比有显著性增加(P＜0.05)。(注：动物对新物体的探索标准：动物口鼻在新奇物体≤2cm范围内，直指向新奇物体或直接接触物体)。 |
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