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铁虫 (初入文坛)

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[交流] 芋螺肽的分支GⅢA简单合成介绍

1.1 GⅢ A-1 的化学结构及合成路线

GⅢA-1 的氨基酸序列为 Arg-Asp-Ala-Cys-Thr-Hyp-Hyp-Lys-Lys- Cys- Lys-Asp-Arg -Gln-Ala-Lys-Hyp-Gln-Arg-Cys-Cys-Ala*（*表示 C-端酰胺化），含有两个链内二硫键 Cys 4 -Cys 20 ， Cys 10 -Cys 21 ）。其合成路线如图1

1.2 GⅢA-1 树脂肽的合成（固相合成）

（1）树脂肽的合成

采用 Fmoc 保护策略固相合成 GⅢA-1 树脂肽。反应在 CEM Liberty 微波辅助全自动多肽合成仪上进行，反应条件为微波功率 35W，反应温度 75℃。树脂采用取代度为 0.74 mmol/g 的聚苯乙烯基 Rink Amide AM 树脂，以 20%哌啶/DMF 溶液作为脱保护剂，肽键形成采用 HBTU 偶联，反应物按树脂载量 5 倍摩尔数投料。合成过程中各侧链保护的氨基酸分别选用 Fmoc-Arg(Pbf)-OH ，Fmoc-Asp(OBu t )-OH， Fmoc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Thr(Bu t )-OH， Fmoc-D-Pro-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Gln(Trt)-OH， „„。多肽链构建完成后，脱除 N-端氨基酸的 Fmoc 保护基。

（2）树脂多肽的获得

树脂肽收缩，从多肽合成仪上取下，加入 DCM 使之悬浮，用真空泵抽滤，加入DCM 洗涤 4-5 次，再用真空泵抽干，称重。

1.3 GⅢA-1-a 的合成（合成和纯化线肽）

（1）裂解

将 1.31 g 树脂肽置于圆口烧瓶中，搅拌下缓缓加入 30 mL 裂解液（TFA： Tis：水=95： 2.5： 2.5， V/V，每克肽树脂需加裂解液 12-15 mL）进行裂解，室温下电磁搅拌反应 1.5 h；

（2）粗肽的获得

裂解液过滤，滤液减压除去 TFA，用冷的无水乙醚沉淀出粗肽。将粗肽转入离心管中，离心，弃去上清液，沉淀物用冷的无水乙醚洗涤 3 次（重复离心过程），将所得粗肽在离心管中晾干，称重；

（3）粗肽的分析

取 0.20 mg粗肽溶于 0.1% TFA/水，溶解后离心，取上清液约 50 μ L进样 HPLC分析，流动相为 A， B 二元梯度， A 为 0.1% TFA/水， B 为 0.1% TFA/乙腈， 60.0 min内 B 从 0%变为 60%，流速 1 mL/min，检测波长为 214 nm；

（4）质谱鉴定

收集 HPLC 主要产物，用 MALDI-TOF-MS 分析。

（5）线肽的纯化

取粗肽 120 mg 溶于约 15 mL 0.1% TFA/水， 0.22μ m 针头过滤器过滤，滤液进样过 HPLC 半制备柱，每次进样量约 8 mg（进样量逐步放大），流速为 3 mL/min的，然后梯度洗脱，流动相为 A， B 二元梯度， A 为 0.1% TFA/水， B 为 0.1% TFA/乙腈， 40.0 min 内 B 从 0%变为 40%，检测波长为 214、 254 和 280 nm；

（6）线肽的冷冻干燥

收集 HPLC 目标组分，收集液用旋转蒸发仪减压除去乙腈，冷冻干燥过夜，称重，取少量溶于 0.1% TFA/水（浓度 1 mg/mL）用 HPLC 分析纯度，其余放置于 4℃冰箱保存备用。得到线肽 40 mg，产率 33.3%。

1.4 GⅢA-1-b 的合成（空气氧化）

（1）线肽的氧化

称取 30 mg GⅢA-1-a，以 0.2 mg/mL 的浓度溶入 150 mL 0.2 M 碳酸氢铵水溶液，电磁搅拌，室温条件下反应；

（2）氧化监测

每 24 h 取约 50 μ L 氧化液进行 HPLC 分析，通过观察出峰时间、峰形变化判断氧化反应是否完全，同时辅以 MALDI-TOF-MS 检测；

（3） HPLC 制备

转化完成后，氧化液用 0.22 μ m 针头过滤器过滤，以 5 mL/min 的流速通过C18 制备柱，然后梯度洗脱，洗脱梯度为 55.0 min 内 B 从 0%变为 55%，检测波长为 214、 254 和 280 nm，用自动收集器收集；

（4）单环肽 GⅢA-1-b 的获得

MALDI-TOF-MS 分析确定目标组分所在管，收集，减压除去收集液中的乙腈，冷冻干燥，称重，取少量溶于 0.1% TFA/水（浓度 1 mg/mL）进行 HPLC 分析纯度，其余放置于 4℃冰箱保存备用。

1.5 GⅢA-1 的合成（碘氧化）

（1）单环肽的碘氧化

称取 30.0 mg GⅢA-1-b 溶于 10 mL 反应溶剂（水：乙腈： TFA=6： 3： 1， V/V）中，加入 3 mL 碘/乙腈溶液（5 mg/mL），使溶液保持发黄的状态；

（2）反应的终止

搅拌反应 30 min 后，加入抗坏血酸水溶液（5 mg/mL），混匀，使溶液呈无色澄清，减压除去乙腈；

（3）分析制备

取样 HPLC 分析，收集主要产物， MALDI-TOF-MS 分析。确定目标产物峰后，反应液经 HPLC 半制备柱制备，收集目标产物，减压除去多余乙腈，冷冻干燥，称重，取少量溶于 0.1% TFA/水（浓度 1 mg/mL）用 HPLC 分析纯度，其余放置于4℃冰箱保存备用。

2.1 结果与讨论

2.1.1 GⅢ A-1 树脂肽的合成（固相合成）

反应完成后，取下树脂肽，经 DCM 洗涤、抽干后，称重 1.6 g。

2.1.2 GⅢ A-1-a 的合成（合成和纯化线肽）

1.6 g 树脂肽经裂解、沉淀、洗涤后得粗肽 500 mg，理论产量 600 mg，产率83%。粗肽用 HPLC 分析(图 2.3)，收集主峰峰尖并进行 MALDI-TOF-MS 分析确定目标峰位置。
150 mg 粗肽用 HPLC 制备得到线肽 GⅢA-1-a 60 mg，产率 40%。线肽用 HPLC分析（图3），收集主峰峰尖并进行 MALDI-TOF-MS 分析，单同位素峰为 2692.4（图 4），与计算值 2692.2 相符。

2.1.3 GⅢ A-1-b 的合成（空气氧化）

30 mg 线肽经空气氧化过夜后，取 50μ L 进行 HPLC 分析（图 5），分析表明原料已经基本消失，收集主峰峰尖，进行 MALDI-TOF-MS 分析确定。氧化反应用制备柱纯化，得到 20 mg GⅢA-1-b，理论产量 30 mg，产率 66%。单环肽用 HPLC分析（如图 6），并进行 MALDI-TOF-MS 分析，单同位素峰为 2690.6(图 6)，与计算值 2690.7 相符。
2.1.4 GⅢ A-1 的合成（碘氧化）

单环肽经碘氧化 30 min 后， HPLC 分析表明，存在两个峰，收集主要产物，MALDI-TOF-MS 分析确定目标产物峰后，反应液经 HPLC 半制备柱纯化，得到 12mg GⅢA-1，理论产量 20 mg，产率 60%。目标肽用 HPLC 分析（图7），收集主峰峰尖并进行 MALDI-TOF-MS 分析，单同位素峰为 2546.1（图8），与计算值相符 2546.1。

2.1.5 讨论

本章主要通过 Fmoc 固相多肽合成法完成了 GⅢA 的合成。在合成的过程中主要得到以下经验：

（1） GⅢA 是天然产物，直接采用空气氧化法即可获得正确配对的产物合成中，缓冲溶液的选择会影响其合成产率。本论文中根据实验室经验选用胱氨酸-半胱氨酸-乙酸铵氧化体系，获得了满意的产率。

（2）在含两个二硫键的衍生物合成中，线肽、单环肽的制备都比较顺利，但是单环肽碘氧化形成目标肽时，遇到了困难，主要体现为部分肽的碘氧化反应不够彻底（HPLC 分析为两个大小接近的双峰）、产率低，分析认为影响碘氧化的因素包括温度、反应时间、碘的用量，而且每个肽的情形也不相同，有的肽碘氧化迅速、彻底，但是有的肽转化很慢且产率很低，需要进行预实验摸索条件。

（3）构建两个二硫键时，除了先进行空气氧化纯化得到单环肽再进行碘氧化外，还可用“一锅法” ，即在空气氧化后，用 TFA 将溶液调节为酸性，直接进行碘氧化。但是，利用“一锅法” 合成不同的肽可能有不同的效果，比如利用该法成功制得了 GⅢA-2，但是制备 GⅢA-3 时目标肽发生丢失，可能与不同肽的亲水性有关。

（ 4）在含一个二硫键多肽的合成中，由于空气氧化时线肽浓度较低（ 0.2mg/mL），为方便进样制备，先旋蒸除去大量水，一般剩余 50 mL 左右。在 GⅢA-2,3 的首次合成中，旋蒸时几乎将氧化液蒸干，加入 0.1% TFA/水溶解后进行制备，发现目标肽丢失。重复该过程有相同结果。分析原因应该是随着水不断减少，NH4 HCO 3 浓度不断加大，使得溶液 pH（0.2 M NH4 HCO 3 溶液 pH 为 8.76）上升，导致了多肽的水解。因此，除水过程应先将 pH 调至酸性。

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