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芋螺肽的分支GⅢA简单合成介绍
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1.1 GⅢ A-1 的化学结构及合成路线 GⅢA-1 的氨基酸序列为 Arg-Asp-Ala-Cys-Thr-Hyp-Hyp-Lys-Lys- Cys- Lys-Asp-Arg -Gln-Ala-Lys-Hyp-Gln-Arg-Cys-Cys-Ala*（*表示 C-端酰胺化） ， 含有两个链内二硫键 Cys 4 -Cys 20 ， Cys 10 -Cys 21 ） 。 其合成路线如图1 1.2 GⅢA-1 树脂肽的合成（固相合成） （1） 树脂肽的合成 采用 Fmoc 保护策略固相合成 GⅢA-1 树脂肽。 反应在 CEM Liberty 微波辅助全自动多肽合成仪上进行， 反应条件为微波功率 35W， 反应温度 75℃。 树脂采用取代度为 0.74 mmol/g 的聚苯乙烯基 Rink Amide AM 树脂， 以 20%哌啶/DMF 溶液作为脱保护剂， 肽键形成采用 HBTU 偶联， 反应物按树脂载量 5 倍摩尔数投料。合 成 过 程 中 各 侧 链 保 护 的 氨 基 酸 分 别 选 用 Fmoc-Arg(Pbf)-OH ，Fmoc-Asp(OBu t )-OH， Fmoc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Thr(Bu t )-OH， Fmoc-D-Pro-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Gln(Trt)-OH， „„。多肽链构建完成后， 脱除 N-端氨基酸的 Fmoc 保护基。 （2） 树脂多肽的获得 树脂肽收缩， 从多肽合成仪上取下， 加入 DCM 使之悬浮， 用真空泵抽滤， 加入DCM 洗涤 4-5 次， 再用真空泵抽干， 称重。 1.3 GⅢA-1-a 的合成（合成和纯化线肽） （1） 裂解 将 1.31 g 树脂肽置于圆口烧瓶中， 搅拌下缓缓加入 30 mL 裂解液（TFA： Tis：水=95： 2.5： 2.5， V/V， 每克肽树脂需加裂解液 12-15 mL） 进行裂解， 室温下电磁搅拌反应 1.5 h； （2） 粗肽的获得 裂解液过滤， 滤液减压除去 TFA， 用冷的无水乙醚沉淀出粗肽。 将粗肽转入离心管中， 离心， 弃去上清液， 沉淀物用冷的无水乙醚洗涤 3 次（重复离心过程） ，将所得粗肽在离心管中晾干， 称重； （3） 粗肽的分析 取 0.20 mg粗肽溶于 0.1% TFA/水， 溶解后离心， 取上清液约 50 μ L进样 HPLC分析， 流动相为 A， B 二元梯度， A 为 0.1% TFA/水， B 为 0.1% TFA/乙腈， 60.0 min内 B 从 0%变为 60%， 流速 1 mL/min， 检测波长为 214 nm； （4） 质谱鉴定 收集 HPLC 主要产物， 用 MALDI-TOF-MS 分析。 （5） 线肽的纯化 取粗肽 120 mg 溶于约 15 mL 0.1% TFA/水， 0.22μ m 针头过滤器过滤， 滤液进样过 HPLC 半制备柱， 每次进样量约 8 mg（进样量逐步放大） ， 流速为 3 mL/min的， 然后梯度洗脱， 流动相为 A， B 二元梯度， A 为 0.1% TFA/水， B 为 0.1% TFA/乙腈， 40.0 min 内 B 从 0%变为 40%， 检测波长为 214、 254 和 280 nm； （6） 线肽的冷冻干燥 收集 HPLC 目标组分， 收集液用旋转蒸发仪减压除去乙腈， 冷冻干燥过夜，称重， 取少量溶于 0.1% TFA/水（浓度 1 mg/mL） 用 HPLC 分析纯度， 其余放置于 4℃冰箱保存备用。 得到线肽 40 mg， 产率 33.3%。 1.4 GⅢA-1-b 的合成（空气氧化） （1） 线肽的氧化 称取 30 mg GⅢA-1-a， 以 0.2 mg/mL 的浓度溶入 150 mL 0.2 M 碳酸氢铵水溶液， 电磁搅拌， 室温条件下反应； （2） 氧化监测 每 24 h 取约 50 μ L 氧化液进行 HPLC 分析， 通过观察出峰时间、 峰形变化判断氧化反应是否完全， 同时辅以 MALDI-TOF-MS 检测； （3） HPLC 制备 转化完成后， 氧化液用 0.22 μ m 针头过滤器过滤， 以 5 mL/min 的流速通过C18 制备柱， 然后梯度洗脱， 洗脱梯度为 55.0 min 内 B 从 0%变为 55%， 检测波长为 214、 254 和 280 nm， 用自动收集器收集； （4） 单环肽 GⅢA-1-b 的获得 MALDI-TOF-MS 分析确定目标组分所在管， 收集， 减压除去收集液中的乙腈，冷冻干燥， 称重， 取少量溶于 0.1% TFA/水（浓度 1 mg/mL） 进行 HPLC 分析纯度，其余放置于 4℃冰箱保存备用。 1.5 GⅢA-1 的合成（碘氧化） （1） 单环肽的碘氧化 称取 30.0 mg GⅢA-1-b 溶于 10 mL 反应溶剂（水： 乙腈： TFA=6： 3： 1， V/V）中， 加入 3 mL 碘/乙腈溶液（5 mg/mL） ， 使溶液保持发黄的状态； （2） 反应的终止 搅拌反应 30 min 后， 加入抗坏血酸水溶液（5 mg/mL） ， 混匀， 使溶液呈无色澄清， 减压除去乙腈； （3） 分析制备 取样 HPLC 分析， 收集主要产物， MALDI-TOF-MS 分析。 确定目标产物峰后，反应液经 HPLC 半制备柱制备， 收集目标产物， 减压除去多余乙腈， 冷冻干燥，称重， 取少量溶于 0.1% TFA/水（浓度 1 mg/mL） 用 HPLC 分析纯度， 其余放置于4℃冰箱保存备用。 2.1 结果与讨论 2.1.1 GⅢ A-1 树脂肽的合成（固相合成） 反应完成后， 取下树脂肽， 经 DCM 洗涤、 抽干后， 称重 1.6 g。 2.1.2 GⅢ A-1-a 的合成（合成和纯化线肽） 1.6 g 树脂肽经裂解、 沉淀、 洗涤后得粗肽 500 mg， 理论产量 600 mg， 产率83%。 粗肽用 HPLC 分析(图 2.3)， 收集主峰峰尖并进行 MALDI-TOF-MS 分析确定目标峰位置。 150 mg 粗肽用 HPLC 制备得到线肽 GⅢA-1-a 60 mg， 产率 40%。 线肽用 HPLC分析（图3） ， 收集主峰峰尖并进行 MALDI-TOF-MS 分析， 单同位素峰为 2692.4（图 4） ， 与计算值 2692.2 相符。 2.1.3 GⅢ A-1-b 的合成（空气氧化） 30 mg 线肽经空气氧化过夜后， 取 50μ L 进行 HPLC 分析（图 5） ， 分析表明原料已经基本消失， 收集主峰峰尖， 进行 MALDI-TOF-MS 分析确定。 氧化反应用制备柱纯化， 得到 20 mg GⅢA-1-b， 理论产量 30 mg， 产率 66%。 单环肽用 HPLC分析（如图 6） ， 并进行 MALDI-TOF-MS 分析， 单同位素峰为 2690.6(图 6)，与计算值 2690.7 相符。 2.1.4 GⅢ A-1 的合成（碘氧化） 单环肽经碘氧化 30 min 后， HPLC 分析表明， 存在两个峰， 收集主要产物，MALDI-TOF-MS 分析确定目标产物峰后， 反应液经 HPLC 半制备柱纯化， 得到 12mg GⅢA-1， 理论产量 20 mg， 产率 60%。 目标肽用 HPLC 分析（图7） ， 收集主峰峰尖并进行 MALDI-TOF-MS 分析， 单同位素峰为 2546.1（图8） ， 与计算值相符 2546.1。 2.1.5 讨论 本章主要通过 Fmoc 固相多肽合成法完成了 GⅢA 的合成。 在合成的过程中主要得到以下经验： （1） GⅢA 是天然产物， 直接采用空气氧化法即可获得正确配对的产物合成中， 缓冲溶液的选择会影响其合成产率。 本论文中根据实验室经验选用胱氨酸-半胱氨酸-乙酸铵氧化体系， 获得了满意的产率。 （2） 在含两个二硫键的衍生物合成中， 线肽、 单环肽的制备都比较顺利， 但是单环肽碘氧化形成目 标肽时， 遇到了困难， 主要体现为部分肽的碘氧化反应不够彻底（HPLC 分析为两个大小接近的双峰） 、 产率低， 分析认为影响碘氧化的因素包括温度、 反应时间、 碘的用量， 而且每个肽的情形也不相同， 有的肽碘氧化迅速、 彻底， 但是有的肽转化很慢且产率很低， 需要进行预实验摸索条件。 （3） 构建两个二硫键时， 除了先进行空气氧化纯化得到单环肽再进行碘氧化外， 还可用“一锅法” ， 即在空气氧化后， 用 TFA 将溶液调节为酸性， 直接进行碘氧化。 但是， 利用“一锅法” 合成不同的肽可能有不同的效果， 比如利用该法成功制得了 GⅢA-2， 但是制备 GⅢA-3 时目标肽发生丢失， 可能与不同肽的亲水性有关。 （ 4） 在含一个二硫键多肽的合成中， 由于空气氧化时线肽浓度较低（ 0.2mg/mL） ， 为方便进样制备， 先旋蒸除去大量水， 一般剩余 50 mL 左右。 在 GⅢA-2,3 的首次合成中， 旋蒸时几乎将氧化液蒸干， 加入 0.1% TFA/水溶解后进行制备， 发现目标肽丢失。 重复该过程有相同结果。 分析原因应该是随着水不断减少，NH4 HCO 3 浓度不断加大， 使得溶液 pH（0.2 M NH4 HCO 3 溶液 pH 为 8.76） 上升，导致了多肽的水解。 因此， 除水过程应先将 pH 调至酸性。  1.png  2.png  3.png  4.png  5.png  6.png  7.png  8.png |
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