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芽孢杆菌电转化实验
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救救孩子吧！！！芽孢杆菌杆菌电转化实验已经做了2个月了一直导不进去！！！用的电转仪为BTX ECM830，时间常数一直都是微秒，有无大佬知道如何更改时间常数吗？方法如下，质粒用的pgfp4412、pgfp78 1、接种芽孢杆菌(B . subtilis)于5ml LB培养基中，过夜培养。 2、取2.5ml过夜培养物接入40ml (LB + 0.5M山梨醇)中，37°C, 200rpm振荡培养至0D6oo为0.85~0.95之 间。 3、将菌液冰水浴10 min,然后5000g，4°C离心5 min,收集菌体。 4、用5oml预冷的电转培养基(o.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖) 重悬菌体，5000g， 4°C离心5min,去上清，如此漂洗4次。 5、将洗涤后的菌体重悬于1ml电转培养基中，分装于EP管，每管分装6oul。. 6、将5ong质粒DNA (1~8μl)加入到6oμl感受态细胞中，冰上孵育2min,加入预冷的电转杯(1mm)中，电击。 电转化参数设置: 2.0kv、 1mm、电击1次。(电击结果: 时间常数=4.5~5.0ms，如果时间常数<4.2,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率)。 7、电击完毕后，取出杯子并立即加入1ml RM (LB + 0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37°C，20orpm振荡复苏培养3h后，涂板。37°C温箱培养过夜。 |
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