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zhl406金虫 (小有名气)
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【求助】分离黄酮类化合物的时候硅胶怎么用浓盐酸预处理啊
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我现在在分的是黄酮类化合物，硅胶没有经过预处理时往往到后面整个柱子都是黑黑的一片，查资料说是硅胶中的重金属引起的，并且硅胶中的铁离子能把大部分黄酮牢牢地吸附在柱子上，解决的办法是先用浓盐酸处理硅胶，我想问一下是像过柱子一样直接把浓盐酸加进去洗脱还是用浓盐酸浸泡还是其他的方法啊，拜托各位虫友给支个招哈，谢谢大家了！！！！ [ Last edited by jw227 on 2009-9-28 at 10:50 ] |
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直接把浓盐酸加进去洗脱或是用浓盐酸浸泡都是不可取的，往后的处理会很麻烦；往往，最后那柱子就废了； 下面是网上找到的一些资料，照着做就行了，不要怕麻烦…… 硅胶的预处理 我们以浓盐酸浸泡硅胶14小时，然后用蒸馏水洗涤硅胶4次后，将起进行减压抽滤，后不断加蒸馏水冲洗。在1小时之后，抽滤的水呈中性，但仍然含有氯离子。经过4小时不断的冲洗才使得抽滤液中基本不含氯离子。晾干一周后，在110℃烘箱中活化2小时。 活化后的硅胶加石油醚浸泡并搅拌均匀。在装柱时，宜使用口径较大的玻璃漏斗置于 层析柱上部，注入1/2高的石油醚，打开下部活塞，然后尽量均匀地将硅胶倾入漏斗，这样可以防止层析柱中形成断层(这一步是实验的关键步骤)。 装柱 装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、 一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量 芗 洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法 。 再提供一些相关资料 http://www.51xuewen.com/group/745/topic_6352.htm 黄铜类的提取与分离 一、提取 黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。 黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等），一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。其中用得最多的是甲醇－水（1∶1）或甲醇。一些多糖苷类则可以用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸（如0.1％盐酸）。但提取一般黄酮苷类成分时，则应当慎用，以免发生水解反应。为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性。大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂，如氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取，对多甲氧基黄酮的游离苷元，可用苯进行提取。 对得到的粗提取物可进行精制处理，常用的方法有： （一）溶剂萃取法：利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。 有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。常用的溶剂系统有：水一醋酸乙酯，正丁醇一石油醚等。 溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。 （二）碱提取酸沉淀法 黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再将碱水提取液调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷提取都应用了这个方法。现以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。 槐米（槐树 SOphora japonica L．花蕾）加约 6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至 pH 8～9，在此 pH条件下微沸 20～30 min，趁热抽滤，残渣再加 4倍量的水煎一次，趁热抽滤。合并滤液，在60～70t的条件下，用浓盐酸将合并滤液调至PH为5，搅匀后静置24 h，抽滤。用水将沉淀物洗至中性， 60℃干燥得芦丁粗品，用沸水重结晶， 70一80℃干燥后得芦丁纯品。 在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过离，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成样盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当药材中含有大量果胶、粘液等水溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其他碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀，不被溶出。这将有利于黄酮类化合物的纯化处理。 （三）炭粉吸附法 主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸附苷的炭末，依次用沸水、佛甲醇、7％酚一水、15％酚一醇溶液进行洗脱。对各部分洗脱液进行定性检查（或用 PPC鉴定）。通过对BaPtisia lecontei中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄酮耷类可用7％酚一水洗下。洗脱液经减压蒸发浓缩至小体积，再用乙酸振摇除去残留的酚，余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。 二、分离 现将较常用的分离方法介绍如下： （一）柱色谱法 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。 1．硅胶柱色谱此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及离度甲基化（或乙醇化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。供试硅胶中混存的微量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。 2．聚酰胺柱色谱 对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。以Baptisialecontei为例：黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下述规律： （1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是：叁糖苷、双糖苷、单糖苷、苷元。 （2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减慢。当分子中羟基数目相同时，羟基位置对吸附也有影响，聚酰胺对处于羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故洗脱顺序为：具有邻位羟基黄酮，具有对位（或间位）羟基黄酮。 （3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄酮醇。 （4）分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层色谱上的行为。 3．葡聚糖凝胶（Sephadex gel）柱色谱对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex－G型及Sephadex－LH－厂－型。用葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机制是： 分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。但分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。 表6-5中Ve为洗脱样品时需要的溶剂总量或洗脱体积； V0为柱子的空体积。Ve／V0数值越小说明化合物越容易被洗脱下来。上表所列数据清楚地表明：苷元的羟基数越多，Ve／V0越大，越难以洗脱，而苷的分子量越大，其上联结糖的数目越多，则Ve／V0越小，越容易洗脱。 黄酮类化合物 取代图式 Ve／ V0 芹菜素 5，7，4’－三羟基 5.3 木犀草素 5，7，3’，4’－四羟基 6.3 槲皮素 3，5，7，3’，4－五羟基 8.3 杨梅素 3，5，7，3’，4’，5’－六羟基 9.2 山奈酚－3－半乳糖鼠李糖7－鼠李糖苷 叁糖苷 3.3 槲皮素－3－芸香糖苷 双糖苷 4.0 槲皮素－3－鼠李糖苷 单糖苷 4.9 葡聚糖凝胶柱色谱中常用的洗脱剂有： （1）碱性水溶液（如 0．1mol／L NH4OH），含盐水溶液（0．5 mol／L NaCI等）。 （2）醇及含水醇，如甲醇，甲醇－水（不同比例），叔丁醇－甲醇（3：1）、乙醇等。 （3）其他溶剂，如含水丙酮、甲醇－氯仿等。 （二）铅盐法 此法过去曾用于研究，目前已很少采用。一般是在乙醇或甲醇溶液中依次加入适量中性醋酸铅、碱式醋酸铅水液，分别使具有邻二酚羟基成分（包括黄酮）及含羟基成分，具有一般酚羟基的成分分离，再分别将铅盐沉淀悬浮于醇中，脱铅后得到成分。 （三）硼酸铬合法 有邻二酚羟基的黄酮类化合物可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此可与无邻二酚羟基的黄酮类化合物相互分离。 （四）pH梯度萃取法 pH梯度萃取法适合于酸性强弱不同的游离的黄酮类化合物的分离，将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）中，依次用5％NaHCO3（萃取出7，4＇－二羟基黄酮）、5％Na2CO3（萃取出7－或4＇－羟基黄酮）、0.2％NaOH（萃取出具一般酚羟基黄酮）、4％NaOH（萃取出5－羟基黄酮）萃取而使之分离。 http://www.cqvip.com/qk/90106a/2003001/7498569.html 黄酮类化合物提取和分离方法研究进展 综述了天然黄酮类物质的9种提取工艺，分别是水提法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法、微波法、超声波法、酶解法、大孔树脂吸附法、超滤法、超临界萃取法。 |
8楼2009-09-28 15:44:30
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知易行难，实验的真谛
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xf4671566
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4楼2009-09-28 12:59:31
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