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合肥肽库生物

新虫 (著名写手)

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[交流] 关于蛋白标签的介绍说明

蛋白标签（protein tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。由于蛋白标签的不同特性，人们在质粒构建时常常遇到多种问题，那么今天小编就来谈谈蛋白标签的那些事。
1、在质粒构建的时候，该选用什么蛋白标签呢？
小编建议根据实验的目的选择不同的性质蛋白标签，常用的蛋白标签有6xHIS、Flag、GST、c-Myc、eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP、HA、SUMO等。

1）6xHis

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6xHis是指六个组氨酸残基组成的融合标签（HHHHHH，编号：184961），可插入在目的蛋白的C末端或N末端，用于对重组蛋白进行分离纯化。His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用。常见的带6XHis的载体有pET-28a(+)、pET-28b、pET-22b(+)、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pACYC-duet1等

2）Flag标签蛋白
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Flag标签蛋白（DYKDDDDK，编号：133742）应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。常见的带有Flag标签的载体有pESC-His、pFLAG-CMV2、pENTR4-FLAG等。
3）c-Myc
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C-Myc 标签蛋白（EQKLISEEDL，编号：162694），是一个含11个氨基酸的小标签，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。常见的载体有pCMV-MYC、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pCMV-RFP-C-Myc、pCMV-Myc等。
4）eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP
分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白,具有不同的激发波长发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。常见的带有eGFP的载体有pEGFP-N1、pEGFP-C1、pcDNA3.1-EGFP、pIRES-EGFP等。
5）SUMO
SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白，研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。常见的带有SUMO标签的载体有pET-SUMO、pET28a-SUMO等。

2、蛋白标签需不需要考虑分子量大小呢？
理论上说蛋白标签越大，对蛋白质本身的功能影响越大，所以大分子标签一般只用于检测或蛋白纯化等。常见的分子量较小的标签有His-Tag、Flag-Tag、HA-Tag、Myc-Tag，这些标签只有几个氨基酸，有很多商品化的抗体，用这些Tag主要用来节省成本，也节约大家制备单抗所需的时间。而大分子的蛋白标签常见的有SUMO、GFP、GST等。

3、蛋白标签都需要去除吗？
一般为了不影响目的蛋白的后续应用，都会选择一定的方式将表达时带上的各种标签去除。所以在设计构建载体时可以在标签蛋白和外源蛋白之间加上蛋白酶识别位点，这样表达纯化得到融合有标签的目的蛋白后通过蛋白酶切的方式将标签去除，得到完整的目的蛋白。这些常用的蛋白酶位点有：HRV 3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUMO蛋白酶切位点等。但是也有几点需要说明：

1）这些酶切位点特异性都比较高，但切割效率各不相同；
2）除了SUMO蛋白酶之外，其它常用蛋白酶切除标签后都会残留几个氨基酸残基。SUMO蛋白酶识别的是SUMO标签的空间结构，然后将这个标签完整切除，不会留下多余的氨基酸残基；
3）蛋白酶的切割效率也受识别位点附近的氨基酸残基性质的影响，具体可以参见有关文献；
4）有些标签比较小，免疫原性也很弱，一般不用切除，也不会对后续研究和应用产生影响，可以不必切除。但是有些大的标签，如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO标签等等，还是需要切除的。

4、蛋白标签是加在N端还是C端呢？
N-端或C-端标记的选择还需要根据蛋白结构、定位等特性。例如对于蛋白太小容易被降解的和比较难表达的蛋白，可以利用5’端的蛋白标签。这样既能保证蛋白的稳定性，也对外源蛋白的免疫原性影响也很小，该法适用于表位筛选。如果目的蛋白是分泌蛋白，就会遇到在目的蛋白分泌到高尔基体的过程中，蛋白5’端的信号肽，会被酶切掉的问题。这样，你标签要是装在5’端，就没什么用了。

5、C端His标签后未马上终止对His标签特性会不会有影响？
His分离纯化的原理为组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析（IMAC），对重组蛋白进行分离纯化，若C端His标签后未添加终止密码子，多余的氨基酸可能会影响His标签的空间构象从而影响其挂壁效果。

参考文献
[1] Carson M , Johnson D H , Mcdonald H , et al. His-tag impact on structure. Acta Crystallographica, 2007, 63(3):295-301.
[2] Lichty J J , Malecki J L , Agnew H D , et al. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif, 2005, 41(1):0-105.
[3] Kim K I, Baek S H, Chung C H. Versatile protein tag, SUMO: its enzymology and biological function. Journal of Cellular Physiology, 2002, 191(3):257–268.
[4] Porath J , Carlsson J , Olsson I , et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 1975, 258(5536):598-9. Terpe K. Protein Tags[M]. 2005.
[5] Wilkins M R, Gasteiger E, Tonella L, et al. Protein identification with N and C-terminal sequence tags in proteome projects. Journal of Molecular Biology, 1998, 278(3):599-608.

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