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渗透性腹泻动物模型的建立方法~
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在我国，慢性腹泻是婴幼儿发病率很高的疾病，6个月至2岁的婴幼儿发病率最高，1岁以内约占50%，对儿童的生长发育及健康危害极大，已成为世界公共性卫生问题。慢性腹泻病因复杂，包括过敏、感染、免疫缺陷、酶缺陷、药物及先天畸形等，以急性感染性腹泻未彻底治疗、迁延不愈最为常见。从病理生理学角度，慢性腹泻病还可细分为渗透性腹泻、分泌性腹泻、动力障碍性腹泻和炎症性腹泻，其中渗透性腹泻在儿童中相对常见。 本次小助手讲解两种渗透性腹泻模型的构建方法，分别是柠檬酸镁腹泻（Mg）组以及乳糖腹泻（Lac）组。 造模方法 选取SD大鼠，体质量300g左右，雌雄各半。Lac组以高乳糖饲料喂养，饮用水采用灭菌纯净水；Mg组以基础饲料喂养，同时以柠檬酸镁溶液代替灭菌纯净水饮用；Con组（正常组）以基础饲料和灭菌纯净水喂养。所有实验大鼠均自由进食和饮水。喂养15d，建立相应慢性腹泻模型。 腹泻情况观察 所有实验大鼠均以单笼饲养，笼底垫铁架，每日同一时间进行体重、饮水量测量和大便观察。观察大便的性状、颜色。对每只大鼠每天的稀便、干便进行计数，用分规和刻度尺测量每一稀便污迹的直径。以腹泻率和腹泻指数作为评判腹泻的主要指标。腹泻指数＝稀便率×平均稀便级。稀便率＝每只动物所排的稀便数÷该动物总便数。稀便级表示每只动物稀便的程度，以稀便的直径分级，分为4级：＜1cm为1级，1～1.9cm为2级，2～3cm为3级，＞3cm为4级。平均稀便级＝所有稀便级数／稀便数。腹泻率（％）＝腹泻的动物数／该组动物总数×100％。 抓力和自主活动度测试 抓力测试： 将腹泻14d后的大鼠置于抓力测试仪上，当它在被人为牵拉尾部向后移动时会本能地抓住测试仪上的铁架以克服后退，当外界对其施加的拉力超过其自身的最大抓力时会被拉离抓力测试仪的铁架，此时，仪器会自动记录抓力的最大值。每一只大鼠重复上述操作5次，每次测试之间让其休息5s，取5次抓力的平均值。 自主活动度测试： 测试前让大鼠在进行实验的房间适应半天。测试开始时把大鼠放置于旷场实验箱中央区，通过动物行为分析系统观察和分析其在旷场试验箱内的活动情况，每只大鼠测试10min，观察指标包括运动总路程和运动平均速度。测试均在下午1时到下午4时之间进行。每次测试结束后，将大鼠放回笼内，清洗旷场实验箱底部和侧壁，喷洒少量75％乙醇，待旷场试验箱干燥无异味后方可进行下一只动物的测试，每只大鼠测量1次。 跨肠上皮电阻测试 取2cm长结肠中段，将肠腔内黏液和肠内容物用PBS溶液轻柔漂洗净，避免损伤肠黏膜，然后将该段肠组织安装在尤斯灌流室中的ussing chamber内固定，膜两侧注入饱和的37℃Krebs液10ｍＬ（Krebs液：NaCl13.67ｇ、NaHCO3 4.2g和葡萄糖3.96g用双蒸水1500mL溶解，加入STOCK液 100mL定容至 2000mL， 4 ℃ 保存。STOCK液的配制：CaCl2 5.56ｇ、KCl7.01ｇ、MgCl2·6H2O 4.88ｇ 和 NaH2PO4·2H2O 3.74g用双蒸水900mL溶解，定容至1000mL，4℃保存），并且分别在灌流室两侧匀速通入5％CO2和95％Ｏ2组成的混合气体，开始进行肠黏膜跨肠上皮电阻检测，每个样本测试时间为1h。对每个样本50～60min区间段的电阻值进行积分，取同组大鼠肠黏膜跨肠上皮电阻平均值。 肠黏膜形态学的观察 剖腹，取2cm小肠下段，2cm结肠中段。用4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，用光镜观察肠黏膜病理学改变。每个实验组取4张不连续切片，每张切片随机选取5个垂直、完整的绒毛，应用图像分析系统测量绒毛高度和绒毛表面积（r为绒毛的半径，h为绒毛的高度，单位以mm表示）。上述肠黏膜观察与肠绒毛测量均在光镜放大100倍下进行。 总结 由腹泻导致的新生儿死亡率高达 17％，对发展中国家5岁以下儿童的生命造成严重威胁，全球每年死于腹泻病的儿童约有200万。腹泻根据病程可分为急性腹泻和慢性腹泻，临床上将腹泻时间超过2周的统称为慢性腹泻。在我国，随着生活环境的改善、生活水平的提高，急性腹泻病（特别是急性重症腹泻）有所减少，但慢性腹泻患儿比例却有上升趋势。国内有学者调查表明婴幼儿迁延性、持续性腹泻约占腹泻病的 62.6％。因此，研究慢性腹泻的发病机制、药物疗效、营养支持等具有较高的临床价值。 |
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