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jiamywsw

新虫 (初入文坛)

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[求助] 求助GFP标记失败原因

做gfp标记细菌，但是做了好久都没标记上，选用的质粒有pgfp4412、pht01-p43gfpmut3a两种，所需标记的菌株是一株鞘氨醇单胞菌，都没转化成功，在此请求哪位大神指点一下，感激不尽~

具体操作如下：
准备转化用的细胞原种
1. 取菌液甘油保存-80°c。
2. 用接种环直接将冻存的菌种在r2a琼脂平板表面划线，在 23°c培养16h。
（没有必要融化冻存的细菌。当接种环在冻存菌种表面上划过时，将附着足量的细胞。一管冻存菌种可以使用很多次。如果培养箱不能设定到23c，可以在室温下孵育r2a平板）
3. 将4或5个分开的菌落转移到含2ml r2a液体培养基的新的干净的15ml培养管中，23°c培养 16h。（菌落直径应该不超过2~3mm。可根据需要设置多个2ml培养物）
4. 在每份培养物中，添加无菌甘油至终浓度为 15%(v/v)。
5. 分装到2.5ml 冻存管中，每管 1ml。将冻存管装入到一个塑料密封袋中，浸入干冰/乙醇浴中5min。
6. 将塑料袋及其内容物转移到-80°c冰箱。

感受态细胞的制备
7. 将1ml小管里的原种细胞接种到r2a液体培养基，20°c培养约8h，测定其在 600nm的光密度，od600值达到0.3-0.4时，停止培养。
8. 当培养物的od600值达到0.4 时，快速地将培养管转移到冰水浴中 15~30min。不时地旋动培养物以保证均匀冷却。在准备用于下一步骤时，将离心管放到冰水浴中。
（为了获得最大的转化效率，确保在本方案中任何阶段细菌的温度都不高于 4°c是至关重要的）
9. 将培养物转移到2 ml 预冷的无菌离心管中。4°c，1800rpm离心 15min，收集细胞。轻轻倒出上清。
10. 用2ml冰冷的超纯水重悬细胞沉淀，轻轻地上下吹打，4°c，1500rpm离心20min，收集细胞。轻轻弃去上清。
11. 重复上述步骤
12. 将细胞沉淀重悬于 1ml冰冷的 10%甘油（超纯水配置）中。4°c， 1500rpm离心20min，收集细胞。轻轻弃去上清。（弃倒上清时要小心，因为在 10%甘油中细菌沉淀的附着力会降低）
13. 将细胞沉淀重悬于 1ml 冰冷的10%甘油中。轻轻地上下吹打混合，4°c，1500rpm离心20min，收集细胞。（当离心机停止时，马上小心地倒出上清液，去除所有剩余的缓冲液液滴。）
14. 将沉淀重悬于100μl 冰冷的 10%甘油中，-80°c冰箱保存（最好的做法是轻轻地旋动，而不是吹吸或漩涡振荡）

电击转化质粒
15. 在冰上融化100μl 感受态细胞，加入8ul的质粒。轻轻混合管子，冰上预冷10 min后
16. 转移至预冷的电击杯（0.1cm）中；将装有混合液的电击杯冰中预冷 5 min 后电击转化
17. 打开电转仪，调至manual，(200 欧姆， 25μfd，1.7千伏)；转化时间随 dna 样品的不同而变化，并由仪器自动给出，一般在 3.5～6.0 ms 范围内;
18. 将电击杯插入电击槽中，将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，检查时间常数t(time const.)按扭，时间常数应在4以上。
19. 迅速向电击杯中加入400μl r2a液体培养基（28℃预热），轻缓地重悬细胞并转移至2 ml 离心管中，28 ℃，180 rpm摇床复苏2 h，同时以未转入质粒的感受态细胞作为对照。
20. 取摇床复苏2 h的转化产物200μl涂布于含有相应抗生素的r2a固体培养基上，放于28 ℃恒温培养箱，静置培养48 h，查看转化结果。
21. 其余菌液按1：1的比例加入30％的甘油后混匀-80℃保存。

发自小木虫Android客户端

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