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影响蛋白质聚集的因素
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1. 蛋白结构 a) 蛋白质的一级结构及疏水氨基酸的相对数目对蛋白质的聚集速率和聚集体的稳定性有较大的影响。疏水氨基酸会形成聚集倾向区域(aggregation-prone region),在特定位置引入一个新的或不同的疏水氨基酸会显著加快蛋白聚集速率。 b) 糖基化对于许多蛋白质的稳定性具有重要意义,如CH2结构域的糖基化可以稳定CH2结构域及整个单抗分子。因此去糖基化可能会干扰单抗的三级结构,进而加速热诱导聚集。甚至蛋白质中糖的结构也会因为改变蛋白质构象稳定性而对蛋白质的聚集产生影响。 c) 蛋白质的二级结构在蛋白质聚集过程中也会发挥一定的作用。研究发现冻干诱导的蛋白质聚集与β-折叠结构有关,而与非极性表面积无关。同时二级结构也会影响巯基-二硫键的交换速率,进而引起分子间形成二硫键而导致聚集。 d) 蛋白的三级结构对蛋白质的聚集也有一定的影响。尽管聚集倾向区域对蛋白质聚集有重要的影响,但若它们被适当的包埋,也依旧会减小蛋白质的聚集。 2. 化学降解 蛋白质会经历多种化学降解途径,尽管许多降解途径(如氧化、二硫键还原、脱氨基等)并不会导致蛋白质三级结构发生明显的变化,然而研究发现化学降解可能会改变蛋白质的构象稳定性或胶体稳定性从而影响蛋白质的聚集。如蛋白质的氧化会增加聚集倾向,糖基化可将正的表面电荷转变为中性或负电荷,进而增加其疏水区域的暴露而导致蛋白质聚集,然而广泛的糖基化则又会保护蛋白减少聚集体的形成。 3. 温度 温度通过影响蛋白质溶液的性质而影响蛋白质聚集,其中包括影响蛋白质的扩散速率、蛋白-蛋白相互作用、蛋白/聚集体溶解性、构象稳定性及化学降解等。温度的升高可能会导致蛋白质部分解折叠的比例的增加、增加蛋白质扩散和碰撞速率而加速蛋白质的聚集。同时,降低温度也可能会导致蛋白质的解折叠,进而也会增加蛋白质的聚集。如核糖体蛋白L9在25oC时变性程度为36%,而在4oC时该值达76%。 4. 溶液条件 蛋白质稳定性强烈地依赖于溶液条件。其中一个关键条件是溶液pH,其可以影响蛋白质的构象和胶体稳定性,进而影响蛋白质的聚集。改变溶液的pH可以改变蛋白-蛋白相互作用的性质和程度、蛋白质聚集体的溶解性、以及成核和聚集体生长的速率。 另一个重要的溶液条件是离子强度,离子强度通过影响蛋白质构象稳定性以及蛋白-蛋白相互作用而影响蛋白质的聚集。溶液离子强度的影响通常取决于溶液的pH。 此外,溶液中的阴阳离子可以通过与蛋白分子的特异或非特异性相互作用而调节蛋白质的聚集。在一些情况下,溶液中的阴离子会对蛋白质的聚集具有更大程度的影响。阴阳离子对聚集影响的差异可能是由于阴离子与蛋白质中阳性集团具有较高的结合倾向。阴离子的影响程度会在一定程度上受极化程度、蛋白溶液条件的影响。 除此之外,一些辅料或添加剂也常被用于减弱蛋白质的聚集。然而,一些公认的蛋白质稳定剂在一定条件下也会引起蛋白质的聚集。如研究发现海藻糖在高浓度(> 500 mM)下会形成分子簇,并会竞争结合蛋白质表面的水分子,故而会导致蛋白质的聚集。表面活性剂如PS由于降解会形成与蛋白质相互作用的不可溶脂肪酸、过氧化物、聚氧乙烯等而导致蛋白质的聚集。 5.生产过程 a) 冻融 冻融会引起许多蛋白质的聚集。这是低温导致的变性/结构扰动、冰导致的蛋白吸附/变性、组分的选择性结晶等一种或多种因素影响的。冻融的速度也会影响蛋白质的稳定性和聚集倾向。 b) 搅拌 搅拌诱导的蛋白质聚集主要归因于以下一种或多种因素:更多气液界面的形成导致蛋白质吸附/解折叠/聚集、剪切力、暴露于疏水表面(如搅拌棒上)、简单磨损等。剪切力导致的蛋白质聚集体会因为不同的剪切条件而产生不同的形貌。研究表明,摇晃小瓶中冻干的IgG1单抗会导致亚可见颗粒的增加及长期物理稳定性的降低。 c) 泵送(pumping) 在样品处理过程中使用泵时会产生一定的潜在剪切力、加压/卸压、蛋白磨损等,进而导致蛋白聚集。尽管研究表明一些蛋白质可以容忍一定程度的剪切力,但是剪切力也常常是导致蛋白产生颗粒、纤维化的原因。此外,泵送过程中的卸压可能会产生气泡,其也会加剧蛋白质的聚集。 d) 光照 光照可在蛋白质中诱导多种光解和非光解的产物,这些降解产物中可能包括具有增强聚集倾向的聚集体或单体。研究表明,在某些情况下,抗体溶液暴露在紫外线或可见光下会形成高分子量聚集体。 e) 冻干 冻干过程会移去部分的蛋白质水化层,这会导致蛋白质的聚集。许多蛋白质在传统的冻干或喷雾干燥过程中会形成聚集体,但相关机理尚未明晰。 f) 其他操作 除此之外,其他操作,如超声或使用经辐射灭菌的注射器也可能会导致蛋白质的聚集。前者会因为气穴、声压或局部温度升高等导致蛋白质的解折叠和聚集;后者会因为辐射灭菌过程中产生的自由基在蛋白质长期存储过程中会促进蛋白质聚集体或颗粒的形成。 6. 潜在的污染物 许多来自生产过程或原材料中的潜在污染物也会影响蛋白质的聚集倾向。如生产设备或原材料中的残留金属污染物会引起一些蛋白质和多肽的聚集。残留的消毒剂,如次氯酸、过氧乙酸可以氧化蛋白质进而导致蛋白质的聚集。 |
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