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[交流] RGD修饰紫杉醇脂质体的制备及其肺癌靶向治疗研究

作者：魏小栋，中国医院药学杂志
目的:制备 RGD修饰载紫杉醇(paclitaxel,PTx)脂质体(RGDLP-PTx),研究其理化性质,并探究其肺癌靶向治疗作用。方法:采用薄膜分散法制备 RGDLP-PTx。  荧光分光光度法研究A549细胞和NCI-H46细胞对普通脂质体(LP)和 RGD 修饰脂质体(RGDLP)的摄取效率。噻唑蓝实验研究不同紫杉醇浓度对 A549细胞和 NCI-H46细胞的细胞毒性;流式细胞仪检测 RGDLP-PTx对 A549细胞和 NCI-H46细胞的凋亡诱导作用。用 A549细胞构建肺癌裸鼠异位肿瘤模型,研究 RG- DLP-PTx的体内抗肿瘤作用。结果:RGDLP-PTx的粒径为(106.3土 15.2)nm,电位为(6.23土 2.2)mV;A549细胞对 RG- DLP-PTx的摄取效率是 LP-PTx的4.4倍,差异有统计学意义(P<0.01);NCI-H46细胞对 RGDLP-PTx的摄取效率是 LP- PTx的3.8倍,差异有统计学意义(P<0.01);RGDLP-PTx对 A549细胞和 NCI-H46细胞的增殖抑制率具有浓度依赖性;在相同紫杉醇浓度下,RGDLP-PTx对 A549细胞和 NCI-H46细胞的增殖抑制率显著强于LP-PTx和游离紫杉醇,差异有统计学意义(P<0.01);RGDLP-PTx,LP-PTx和游离紫杉醇诱导肺癌 A549细胞的凋亡率分别为48.3%,27.4%和35.5%,与生理盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.01);NCI-H46 细胞凋亡率分别为41.3%,22.8%和34.1%,与生理盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。RGDLP-PTx,LP-PTx和游离紫杉醇对肺癌肿瘤的抑制率分别为69.3%,47.5%和24.4%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:RGD修饰载紫杉醇脂质体能够高效抑制肺癌细胞的增殖和肿瘤的生长,是一种有效的肺癌靶向给药系统。

肺癌是当前严重威胁人类健康的疾病。当前肺癌的治疗主要以手术为主 ,辅以放疗和化疗[1-2·,化疗药物的全身分布对患者正常的组织产生严重的毒副作用。近年来 ,研究具有肿瘤靶向性的药物成为了抗肿瘤研究领域的热点[3·。有报道显示 ,肺癌细胞表面有大量的整合素受体表达[4-6·,RGD与整合素受体具有特异亲和力 ,能够与整合素受体特异性结合 ,因此 RGD可以连接到纳米载体表面用于肿瘤靶向研究[7-9·。本研究将整合素受体特异性配体 RGD连接到脂质体表面 ,以紫杉醇为模型药物 ,研究 RGD修饰的紫杉醇脂质体的体内外肺癌靶向治疗作用。

1 材料

BALB/c裸鼠购自武汉大学实验动物中心 ,雄  性 ,8周龄 ,体质量19~20g,饲养于SPF级动物房 , 许可证号:WD2013-082;A549肺癌细胞和 NCI- H46细胞购自美国 ATCC细胞库;紫杉醇(江苏恒  瑞药业 ,批号 130011);1640培养基(维森特生物有  限公司);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物科技公  司);0.25%胰酶(Gibco公司);大豆磷脂(SPC,美国 Sigma公司); DSPE-PEG2000、FITC标记磷脂、DSPE-PEG2000- MAL(美国 Avantipolarlipids)。

2 方法

2.1 RGD修饰紫杉醇脂质体(RGDLP-PTx)的制备    参照文献[10]合成 RGD-PEG2000-DSPE。简言之 ,将 DSPE-PEG2000-Mal用适量氯仿溶于茄形瓶中 ,旋转蒸发除去溶剂成膜 ,真空干燥过夜。加入适量 PBS缓冲液(pH 7.4)水化 1 h(37℃ ,200r· min-1),水浴超声5 min使形成均匀的 DSPE- PEG2000-Mal胶束溶液。将 cRGDfK多肽溶于适  量 PBS缓冲液中 ,加人 DSPE-PEG2000-Mal胶束溶液 ,N2保护下 4 ℃搅拌反应直至 TLC薄层色谱(展开剂 MeOH

CM=1:10)鉴定 DSPE-PEG-Mal 点基本消失。得 DSPE-PEG2000-RGD。参照文献 [11]使用薄膜分散-超声法制备 ,将处方量的 SPC, Cho,DSPE-PEG-RGD,DSPE-PEG-OMe,FITC-PE[保证总磷脂:胆固醇=65:35(摩尔比)]和紫杉醇分  别溶于氯仿 ,置茄形瓶中抽干成膜。加人2.5 ml PBS缓冲液(pH 7.4),置空气浴摇床中 ,37℃ ,180 r·min-1 ,振摇 20min后 ,探头超声(80W ,5 s,15 次)制备得到 RGDLP-PTx。用相同量的 DSPE- PEG-OMe取代DSPE-PEG-RGD 制备得到 LP- PTx.取制备得到的脂质体用 SizerNanoZS90型激  光粒度仪及 ZETA电位分析仪测定其粒径和电位。取适量脂质体采用冷冻超速离心机离心30min后 , 取上清液用甲醇破乳 ,用 HPLC法在 227nm检测  紫杉醇包封率。DiamonsilC18 色谱柱(200mmx  4.6 mm,5 以m);流动相:乙腈-水(50:50);检测波长:227nm;柱温:35℃;流速:1ml·min-1 ;进样量: 20以l。包封率% =M上清液 /M投药量x100% 。取适量  RGDLP-PTx铀负染后于透射电镜下观察其形态。

2.2 细胞摄取试验将 A549细胞和 NCI-H46 细胞以 1x 105个的密度分别接种于24孔板内 ,用含血清的培养基培养 48h,移去培养基 ,分别加人FITC标记的 RGDLP-PTx和 LP-PTx,加培养基  调整脂质体的终浓度。37℃孵育 60min后 ,弃去  脂质体悬液 ,将细胞用冷PBS漂洗 3次 ,洗去吸附在细胞表面的脂质体。每孔加人 1ml1%Triton溶液于37℃孵育 20min以裂解细胞。吹打混匀后 , 吸取 100以l留样 ,余下 900以l稀释至3 ml后 ,用荧光分光光度法(Ex =488nm,Em  =525nm)测定其  荧光强度。

2.3  细胞毒性试验取生长状态良好并处于对数生长期的 A549细胞和 NCI-H46细胞 ,以细胞密度 1x104个接种于96孔培养板中 ,在 37℃、5% CO2及饱  和湿度条件下的细胞培养箱中培养24h,待细胞完全  贴壁后 ,观察细胞融合度在80%左右且细胞形态饱  满后 ,弃去培养基 ,加人 RGDLP-PTx,LP-PTx和游  离紫杉醇样品 ,用新鲜不含血清的基础培养基调节阿  霉素由低至高分别为0.3,3,10,20,30以g·ml-1溶液。共同孵育 24h后弃去供试悬液 ,加人新鲜培养基继  续培养24h后 ,弃去培养基 ,每孔加人20以l的 5mg· ml-1 MTT的 PBS溶液(pH7.4)及180以l新鲜不含  血清培养基补足体积 ,在微量振荡器上振荡 3 min,将  培养板移人培养箱 ,继续孵育 4 h之后 ,移去培养基 , 每孔加人20以l的 DMSO,37℃振摇孵育 15min,然  后在 570nm处 ,用酶标仪测定各孔的吸光度(A值)。每组设置3个复孔。

2.4 细胞凋亡诱导试验 A549细胞和NCI-H46 细胞用含10%胎牛血清的1640培养基培养 ,用  0.125%胰酶消化成单细胞悬液后计数 ,按 2x 105 个/孔的密度接种于直径为 35mm 的圆形培养皿中 ,在 37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养 24h, 待细胞完全贴壁生长后 ,更换孔内培养基 ,每个细胞孔加人 4 ml新鲜含血清培养基 ,再加人 20 以l的  RGDLP-PTx,LP-PTx和游离紫杉醇 ,将培养皿置于 37℃ ,5% CO2条件下孵育 4 h后 ,吸出孔板内液  体 ,PBS洗2遍 ,每孔加人 6 000以l新鲜培养基 ,继  续培养 96h后 ,进行凋亡测定。

2.5  肺癌移植瘤的构建 A549荷瘤裸鼠模型的建立参照文献进行 ,将 8周龄的雄性 BALB/c裸鼠用 8%水合氯醛麻醉(腹腔注射 ,40mg·kg-1)后 ,将 A549细胞消化后离心 ,PBS洗2遍 ,将细胞重悬于无血清的新鲜 1640培养基中 ,之后按每只 1x106个细胞(10以l)的量 ,皮下注射接种于 BALB/c鼠背部 ,12 ~14d后 ,背部肿瘤直径达到 10~14mm,可用于后续试验。在第3,6,9,12天进行尾静脉给药。

3 结果

3.1 RGDLP-PTx的表征制备得到的 RGDLP-PTx的粒径为(106.3土 15.2)nm,电位为(6.23土 2.2)mV。紫杉醇的包封率为(86.73土8.4)% 。见表 1。投射电镜观察 RGDLP-PTx如图 1所示 ,脂质体呈球形 ,均一性良好。

3.2 细胞摄取试验细胞摄取试验结果显示 , A549细胞对 RGDLP-PTx的摄取效率是 LP-PTx 的4.4倍 ,差异有统计学意义 (P<0.01)。NCI- H46细胞对 RGDLP-PTx的摄取效率是 LP-PTx 的3.8倍 ,差异有统计学意义(P<0.01),见图 2。

3.3  细胞毒性试验 MTT试验结果如图 3所示 , RGDLP-PTx对 A549细胞和 NCI-H46细胞的增  殖抑制率随着紫杉醇浓度的增加而增强。在相同紫  杉醇浓度下 ,RGDLP-PTx对 A549细胞和 NCI- H46细胞的增殖抑制率显著强于 LP-PTx和游离  紫杉醇(P<0.01)。

3.4  细胞凋亡试验细胞凋亡试验结果如图 4所示 ,RGDLP-PTx、LP-PTx和游离紫杉醇诱导肺癌 A549细胞的凋亡率分别为 48.3% ,27.4% 和 35.5% ,与生理盐水组比较 ,差异有统计学意义(P<0.01);GDLP-PTx对 A549细胞的凋亡率与 LP- PTx和游离紫杉醇比较 ,差异有统计学意义(P<  0.01);NCI-H46 细胞凋亡率分别为 41.3% , 22.8%和34.1% ,与生理盐水组比较 ,差异有统计学  意义(P<0.01);RGDLP-PTx 对 NCI-H46 细胞  的凋亡率与 LP-PTx和游离紫杉醇比较 ,差异有统  计学意义(P<0.01)。

3.5 肿瘤生长抑制试验不同紫杉醇对 A549荷瘤裸鼠肿瘤的生长抑制试验结果如表 2所示 ,RG- DLP-PTx,LP-PTx和游离紫杉醇对肺癌肿瘤的抑制率分别为 (69.3 土 3.23)% ,( 47.5 土 2.16)%和 (24.4土1.45)% ,差异有统计学意义(P<0.01)。

4  讨论

紫杉醇是目前临床上常用的细胞毒性化疗药  物 ,已经被用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部肿  瘤和非小细胞肺癌的治疗[12]。然而由于其毒副作  用导致其临床应用受到了一定的限制。随着纳米技  术的发展 ,脂质体、纳米粒和聚合物胶束被用于包载  抗肿瘤药物 ,利用肿瘤组织的 EPR(enhancedper- meabilityandretentionefect)效应到达肿瘤组织 , 进人肿瘤组织发挥抗肿瘤作用[13]。脂质体由于其  良好的生物相容性被广泛研究。在脂质体表面连接  具有肿瘤靶向性的多肽或受体能够增强脂质体进人  肿瘤细胞的能力。整合素是一类细胞黏附受体分  子 ,在所有的有核细胞表面均广泛表达 ,其在体内能  够介导细胞与细胞之间 ,以及细胞与细胞外基质的  相互黏附[14]。整合素是由 a和 β亚基通过非共价  键结合形成的异二聚体 ,其中整合素 avβ3在神经胶  质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞及肿瘤相关  的内皮细胞表面高度表达 ,与肿瘤的血管发生 ,肿瘤  转移及肿瘤的抗放射治疗密切相关 ,因此整合素  avβ3常被用作肿瘤靶向的特异性靶点[15-16]。  已有  研究表明 ,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)的三肽序列能够特异性地识别含 av亚基的  整合素家族 ,进一步的研究也已证实 ,具环状结构的  RGD能够显示出和整合素 avβ3、avβ5的高度亲和  力 ,其与整合素 avβ3的亲和力约为线性 RGD 的 1 000倍[17]。本研究将整合素受体的特异性配体  RGD肽连接到脂质体表面 ,对其肺癌靶向性和肺癌  细胞增殖抑制能力进行研究。

本研究采用薄膜分散法制备 RGD修饰的紫杉醇脂质体。脂质体的粒径约 100nm,能够有效地利用肿瘤组织的 EPR效应到达肿瘤组织 ,再利用肿瘤组织表面的整合素受体介导脂质体进人肿瘤细胞内部。体外细胞摄取试验结果证实 A549细胞和 NCI-H46细胞对 RGD修饰的紫杉醇脂质体的摄取效率都被增强。  细胞毒性试验结果证实 ,RG- DLP-PTx对 A549细胞和 NCI-H46 细胞的增殖抑制能力显著强于其他 LP-PTx和游离紫杉醇。在研究中 ,我们发现游离紫杉醇溶液对肺癌细胞的  增殖抑制能力强于 LP-PTx,这是由于紫杉醇是难  溶性药物 ,必须用乙醇和蓖麻油混合溶液配制 ,其溶  剂毒性较大 ,导致细胞实验过程中产生了比 LP- PTx更强的细胞毒性。在体内肿瘤生长抑制试验  中 ,LP-PTx对荷瘤裸鼠肿瘤生长抑制能力强于游  离紫杉醇 ,这与体外细胞增殖抑制实验结果不一致 , 这是由于 LP-PTx能够通过 EPR效应蓄积到肿瘤  组织 ,发挥抗肿瘤作用。经过 RGD修饰的紫杉醇  脂质体能够增强紫杉醇抗肿瘤生长作用。综上所  述 ,RGD修饰的紫杉醇脂质体能够有效抑制肺癌细  胞增殖 ,并诱导肺癌细胞凋亡和抑制荷瘤裸鼠肿瘤  的生长 ,是一种有效的肺癌靶向给药系统。

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