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firefly75

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小心点(金币+4,VIP+0):哦,是这个样子啊,非常感谢!! 10-2 16:05
amisking(金币+6,VIP+0): 10-2 16:39
引用回帖:
Originally posted by 小心点 at 2009-9-24 18:50:

用蛋白酶K?在哪一步?蛋白酶K不也是杂蛋白,怎么把蛋白酶K除去?

就是你用于跑电泳的质粒提取物啊,可以用蛋白酶K处理后再用酚抽提。我也提取过乳酸菌质粒,也是出现你这样的电泳图,不过我的质粒带比你明显,据我估计这种结果的影响可能是蛋白或者是糖类,还有可能是SDS残留,此外RNA太多也会明显影响DNA的泳动行为(你的RNA含量太高,强烈建议先除RNA,再依次用蛋白酶K和酚处理;电泳时尽量减少上样量,可以用几个不同上样量在同一块胶上电泳试试,说不定可以得到你想要的结果,因为有可能是上样量大,泳动时质粒与RNA、基因组DNA、多糖等杂质相互纠缠,形成这样一个以质粒带为中心的弥散的谱带;我最初怕提不到质粒,上样量很大,得到的图与你的图相似,减少上样量后,效果可以得到很大改善);我提取的质粒经处理后可以很容易用限制酶切开。现在我使用胶回收试剂盒进行纯化(无需Proteinase K处理,也无需先跑胶,不过先得用少量样品跑胶检测你的质粒提取液中是否有质粒,^_^),也就是先用常规的碱法大提质粒,在提取的质粒溶液中加入3倍体积(一般都是这样吧)的溶胶溶液(试剂盒里的),后面步骤同胶回收,可以得到很好浓缩和纯化后的质粒电泳带,后继实验也都能正常进行的。发个图,Marker左边是未纯化 的质粒,右边是柱子纯化后的质粒,浓度和纯度得到很大的提高(因没有凝胶成像系统,相机拍的照片质量较差,^_^。这个质粒提取于一株戊糖乳杆菌[lactobacillus pentosus],也是自己分离的,呵呵,与植物乳杆菌可是近亲,它们的16SrDNA是同源的,^_^):

[ Last edited by firefly75 on 2009-9-30 at 16:29 ]
11楼2009-09-30 15:26:25
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firefly75

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by 小心点 at 2009-9-26 20:39:

不是质粒弥散,是杂质,最终沉淀明显有很多白色的物质~

我认为很有可能是质粒的弥散,因为上样量太大后质粒、Rna、基因组DNA、多糖等(加样孔有条带,有可能有基因组DNA或/和多糖类)相互纠缠,电泳时,与RNA纠缠的质粒跑的快,与基因组Dna、多糖纠缠的质粒跑的慢,在泳动过程中,纠缠态质粒因稀释和电场力作用逐渐脱离被纠缠状态,所以形成谱带,而相对较多的没有纠缠的质粒形成谱带的中心条带。
12楼2009-09-30 16:25:54
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小心点

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by firefly75 at 2009-9-30 16:25:


我认为很有可能是质粒的弥散,因为上样量太大后质粒、Rna、基因组DNA、多糖等(加样孔有条带,有可能有基因组DNA或/和多糖类)相互纠缠,电泳时,与RNA纠缠的质粒跑的快,与基因组Dna、多糖纠缠的质粒跑的慢, ...

原来是这样啊,谢谢。我一直都没考虑到上样太多的原因,前几天酶切之后发现酶切条带比质粒要清晰,我才意识到可能是质粒用多了。回头试试少上点样。
13楼2009-10-02 16:16:20
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