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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 乳酸菌质粒电泳问题
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firefly75

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小心点(金币+4,VIP+0):哦，是这个样子啊，非常感谢！！ 10-2 16:05
amisking(金币+6,VIP+0): 10-2 16:39
引用回帖:
Originally posted by 小心点 at 2009-9-24 18:50:

用蛋白酶K？在哪一步？蛋白酶K不也是杂蛋白，怎么把蛋白酶K除去？

就是你用于跑电泳的质粒提取物啊，可以用蛋白酶K处理后再用酚抽提。我也提取过乳酸菌质粒，也是出现你这样的电泳图，不过我的质粒带比你明显，据我估计这种结果的影响可能是蛋白或者是糖类，还有可能是SDS残留，此外RNA太多也会明显影响DNA的泳动行为（你的RNA含量太高，强烈建议先除RNA，再依次用蛋白酶K和酚处理；电泳时尽量减少上样量，可以用几个不同上样量在同一块胶上电泳试试，说不定可以得到你想要的结果，因为有可能是上样量大，泳动时质粒与RNA、基因组DNA、多糖等杂质相互纠缠，形成这样一个以质粒带为中心的弥散的谱带；我最初怕提不到质粒，上样量很大，得到的图与你的图相似，减少上样量后，效果可以得到很大改善）；我提取的质粒经处理后可以很容易用限制酶切开。现在我使用胶回收试剂盒进行纯化（无需Proteinase K处理，也无需先跑胶，不过先得用少量样品跑胶检测你的质粒提取液中是否有质粒，^_^），也就是先用常规的碱法大提质粒，在提取的质粒溶液中加入3倍体积（一般都是这样吧）的溶胶溶液（试剂盒里的），后面步骤同胶回收，可以得到很好浓缩和纯化后的质粒电泳带，后继实验也都能正常进行的。发个图，Marker左边是未纯化 的质粒，右边是柱子纯化后的质粒，浓度和纯度得到很大的提高（因没有凝胶成像系统，相机拍的照片质量较差，^_^。这个质粒提取于一株戊糖乳杆菌[lactobacillus pentosus]，也是自己分离的，呵呵，与植物乳杆菌可是近亲，它们的16SrDNA是同源的，^_^）：

[ Last edited by firefly75 on 2009-9-30 at 16:29 ]
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11楼2009-09-30 15:26:25
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firefly75

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 小心点 at 2009-9-26 20:39:

不是质粒弥散，是杂质，最终沉淀明显有很多白色的物质~

我认为很有可能是质粒的弥散，因为上样量太大后质粒、Rna、基因组DNA、多糖等（加样孔有条带，有可能有基因组DNA或/和多糖类）相互纠缠，电泳时，与RNA纠缠的质粒跑的快，与基因组Dna、多糖纠缠的质粒跑的慢，在泳动过程中，纠缠态质粒因稀释和电场力作用逐渐脱离被纠缠状态，所以形成谱带，而相对较多的没有纠缠的质粒形成谱带的中心条带。
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12楼2009-09-30 16:25:54
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小心点

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by firefly75 at 2009-9-30 16:25:


我认为很有可能是质粒的弥散，因为上样量太大后质粒、Rna、基因组DNA、多糖等（加样孔有条带，有可能有基因组DNA或/和多糖类）相互纠缠，电泳时，与RNA纠缠的质粒跑的快，与基因组Dna、多糖纠缠的质粒跑的慢， ...

原来是这样啊，谢谢。我一直都没考虑到上样太多的原因，前几天酶切之后发现酶切条带比质粒要清晰，我才意识到可能是质粒用多了。回头试试少上点样。
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13楼2009-10-02 16:16:20
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