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新虫 (著名写手)

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[交流] 内毒素与外毒素的区别，内毒素检测及去除方法

本文主要介绍内毒性，及其毒性反应。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。内毒素不是蛋白质，因此非常耐热。

内毒素与外毒素的区别
内毒素与外毒素不同之处在于：内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素；把内毒素注射到机体内虽可产生一定量的特异免疫产物（称为抗体），但这种抗体抵消内毒素毒性的作用微弱。

内毒素检测方法
1、凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.5ml/支或者更大装量，使用时应加除热原水（细菌内毒素检查用水）复溶后使用。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。

2、动态浊度法、终点浊度法、动态显色法、终点显色法，这四种方法都是定量检测内毒素的。根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。终点浊度法未见商品化产品。动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

3、终点显色法和动态显色法都是属于显色基质法。显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法，根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。

内毒素去除方法
1、超滤膜和荷电微孔滤膜法

由于内毒素具有较大的相对分子质量，因此可选用超滤膜去除水中的内毒素。超滤膜的孔径及材质的选择，需视被处理药物的相对分子质量、特性、及药品中热原的含量而定。如要截留大部分热原，需采用截留相对分子质量为5000或10000的超滤膜，此时操作过程中的压力较高，另外对部分含有较大相对分子质量成份的医药制剂也不合适。因为在除去热原的同时会阻留或吸附药液中的有效成份，使产品收率大受影响。

由于内毒素分子在中性条件下本身带负电荷，因而选择带有正电荷的材质如聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等微孔滤膜可增强对内毒素分子的去除效果，另外，也有人将硅藻土涂渍在纤维素膜上，然后在其上吸附上荷正电聚电解质，用于去除内毒素。但这些荷电微孔滤膜对内毒素的去除效果受pH的影响较大。

2、石棉及活性炭吸附法

活性炭用于去除内毒素是由于内毒素的相对分子质量较大，这种方法适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中内毒素的去除。比较适合纯水溶液中内毒素的去除。但由于活性炭的选择性较差，易吸附有效成份，且纯化后溶液中的残余活性炭不易去除，因此目前已很少使用。

3、化学降解法

化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除。这种方法有可能造成目标产物的流失、降解或失活，因此对于具有生物活性物质溶液中的内毒素去除显然是不利的。

4、相分离法

Liu等发展了一种采用Triton X-114从大量重组体蛋白制品中去除内毒素的方法。据此文报道，利用这种相分离法，对内毒素的去除率达99%以上，对蛋白质的回收率大于90%，且不影响有效成份的活性。

5、离子交换色谱法

离子交换色谱法是根据内毒素带有部分负电荷的性质，用阴离子交换色谱来去除内毒素，但这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。如二乙基胺乙基（DEAE）阴离子交换介质适于从碱性蛋白质中去除内毒素，成本低，吸附容量大。Chibata等人采用一种以吸附剂吸附溶液中的内毒素的方法去除内毒素。吸附剂由不溶于水的载体（如Cellulose）和含氮杂环的化合物（R-A-X）组成，其中R是含氮杂环基团，A是烷基或链烯基，X是H原子或作用基团。含氮杂环和烷基可由一个或多个取代物选择性取代，此化合物直接或通过间隔臂连接到载体上。

6、亲和色谱法

亲和色谱法是利用物质的生物学特性来达到物质的分离，是去除内毒素的一种较为理想的方法。只要采用适当的配基，将它固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，就可使它成为一种去除内毒素的高效能、高选择性方法。相对于上述方法来说，亲和色谱法具有其显著的优越性，去除率高、选择性好。

自80年代起，组胺、组氨酸就开始用作去除内毒素的亲和配基。Satoshi Minobe报道，以组氨酸为配基的柱介质在低离子强度（I = 0.02），pH 3 ~ 8的条件下，对内毒素的去除效果最好。商振华等在此基础上制成了以组氨酸为配基的聚酰胺膜介质，在所选择的最佳条件下成功地应用于BSA、溶菌酶等生物制剂中内毒素的去除。Legeklallails等则成功地利用组氨酸为配基的中空膜（PEVA）去除了IgG中的内毒素。

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