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多肽抗原免疫
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动物选择 要生成好的抗体，必须选择与抗原源差异较大的动物。要想获得大的免疫反应，绝对不能让免疫动物对抗原产生‘自体识别’。例如，要想生成抗人体蛋白的抗体，使用兔或老鼠比使用猴子要好。对于非常保守的哺乳动物蛋白，使用鸟类动物（如鸡）效果较好。 动物免疫 我们通常使用弗氏佐剂（Freunds）与抗原进行混合。次注射完全使用Freunds的免疫辅助剂。辅助剂与抗原联合使用，可以提高免疫反应，从而用较少的疫苗可以产生较强的免疫反应。佐剂可以使抗原缓慢释放，从而产生持续性刺激。注射方式为多位点的皮下注射。每只注射动物都要先收集免疫前血样，以用于和以后的免疫血样比较。所采集的血清样本含有不同的免疫型和亚型。 抗原准备－交联方法 化学合成的多肽抗原是小分子， 本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T－帮助细胞，进而诱导 B－细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中常用的是keyhole limpet hemacyanin (KLH), 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）, 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲状腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是为常用的多肽交联载体。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。 设计合成性多肽常常被忽略的一个方面是如何将多肽交联到载体蛋白上。例如，N－端序列需要通过C－端氨基酸交联，而C－端序列则需要通过N－端氨基酸交联。内部序列则可以交联到任何一端。内部序列交联的另一考量则是将非共轭端酰基化或氨基化，因为原蛋白分子序列中不会含有带电荷的末端。常用的交联方法都是基于自由氨基(alph-氨基 或 Lys)、sufhydryl (Cys)或羧基集团(Asp, Glu, 或 alpha-羧基)的存在。的交联方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽交联到载体蛋白上。所选序列不能有多个残基都能参与所选交联化学反应。如果多个反应位点存在，可以考虑将多肽序列缩短，或者选择反应位点都位于一端的多肽。对于内部序列通常会使用离所预测抗原位点较远的一端进行交联，这样可以避免可能的屏蔽问题。 抗体鉴定 检测抗多肽反应是否发生的简单方法就是抗多肽ELISA。有两种技术可以将多肽链接到ELISA板上。种方法就是直接将多肽链接到盘上。但如果链接氨基酸恰好是抗原决定簇的一部分，则抗体无法和多肽进一步链接，这样产生假阴性结果的可能性增加。第二种方法则是先将多肽与载体蛋白耦合，然后将多肽－蛋白 耦合体链接到ELISA盘上。这种链接方法会使抗体－多肽的结合成功率提高，因为多肽不是直接嵌入盘膜，因而会更加暴露给抗体。这种方法因而更可靠，可重复性更高。需要注意的是，用于该方法的载体蛋白必须不同于用于免疫耦合的载体蛋白。这样会避免血清中抗载体蛋白反应所导致的高背景反应。 当做血清检测时，另一点需要记住的是，由于免疫多肽与自然多肽结构上的差别，检测时的抗多肽反应与试剂的抗多肽反应可能是不同的。任何检测，尤其是测定滴定量以决定收获点时，必须包括针对天然状态下蛋白的检测。当然可以做针对天然状态下蛋白的ELISA；但由于血清在不同检测体系中表现会不一样，因此好在血清被日常使用的体系中进行蛋白识别鉴定。如果血清将用于免疫沉淀反应，就应该进行针对该反应的检测。 多肽的序列的设计 多肽是用来模拟蛋白的，为了模仿蛋白的表现，我们需要合成与蛋白有相似的结构和电荷的多肽 。当一条肽段从一个蛋白中“切出”之后，两端的电荷数将与基因体蛋白有差异。我们需要改变合成策略来使他们一致。 总体而言： 如果是出自蛋白C端的序列，通过乙酰化将N端屏蔽； 如果是出自蛋白N端的序列，通过酰胺化将C端屏蔽； 如果是出自蛋白中间部分，用乙酰化和酰胺化将两端都屏蔽 多肽纯度的定义 多肽的纯度通常是通过HPLC，用每分钟1%的标准乙腈梯度来检测决定的。合成过程中，氨基酸之间的交联效率不是总能达到100%，因而产生一系列的氨基酸缺失的杂质。大多数这样的氨基酸缺失的杂质在纯化过程中都被去掉了，但有少数的杂质其色谱表现与目标多肽很相近。这些氨基酸缺失的杂质肽留在了多肽样品中就构成了余下的几个百分点。 多肽的净含量 干品多肽的重量中不仅仅包含多肽，还包含有一些非肽的组份，如水，被吸收的溶剂、配位离子和盐等。肽的净含量是指肽在其中的重量百分比，这个百分比的数值范围很大，可能从50%到90%，取决于纯度、序列以及合成和纯化的方法，不要将肽的净含量和肽的纯度混为一谈， 它们是完全不同的两个概念。纯度通常是由HPLC决定的。纯度定义的是多肽样品中含正确序列的组分的百分比， 而肽的净含量是指样品中肽类物质相对于总物质所占的百分比，肽的净含量通常是用氨基酸组分分析或紫外分光法测定的。这个信息主要是在一些对肽的浓度很敏感的实验中，对计算肽的浓度是很重要的。 MAP的应用 MAP是复合抗原多肽，是将线型多肽的C端连接在多聚Lys核心上形成的分枝多肽，从而增大了整个分子的大小。虽然MAP减少了多肽与KLH交联的步骤，然而由于MAP多肽的构象活动空间有限，通过它产生的抗体与通过KLH交联法产生的抗体相比常常不能被蛋白识别。再者，做MAP时没有自由的肽产生，因而很难除去对多聚Lys核心部分产生的抗体。HPLC纯化MAP很困难。而且由于MAP分子的不均一性和很大的分子大小，也不能提供质谱鉴定。 抗原多肽交联中常见问题 1、多肽与载体蛋白交联 对在动物体内产生免疫反应而言，大多数多肽的分子量都太小。将多肽与载体蛋白如KLH等交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。我们可以提供与KLH和BSA两种蛋白的交联。大多数客户选择与KLH交联，因为KLH的免疫性更好，而且BSA在很多实验中作为Blocking试剂，由于动物体内既会产生对多肽的抗体也会产生对载体蛋白的抗体，这样会出现假阳性。 2、抗体的使用 由于抗体与很多生物分子，以蛋白和多肽等尤为显著，有很强的结合能力，抗体在生物医学研究中占据独特的重要地位，在对蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都需要用到抗体。例如：诊断试剂盒如早孕试剂盒等，蛋白microalloy、immunohistochemistry 和普通的ELISA实验等。由于抗体有对特定分子很强的结合能力的特点，用抗体进行体内治疗成了许多努力的方向。成功的范例包括Genetech的Herceptin,用于治疗一类特殊的乳腺癌和IDEC药业公司的Ritaxan，用于特定类型的Non-Hodgkin`s Lymphomas B-细胞。 3、抗原和识别区域： 大多数情况下，antigen和immunogen两个字是可以互换使用的，它们的差别是很小的。他们是分别指一个分子与免疫系统之间的两种类型的相互作用。一个immunogen是指能使一个生物组织的免疫系统产生免疫反应的分子，而一个antigen是指能与这种免疫反应的产物结合的分子，所以immunogen一定是antigen，但antigen不一定是immunogen，我们这里通用antigen，特指能与免疫反应的产物—抗体结合的分子。 识别区域（epitopes）是指一个抗原分子中一个与抗体直接结合的一段特定的序列，对于任何抗原（抗原蛋白），很有可能有多个抗体识别区域，对生产抗体而言，易于抗体识别的部位的识别区域为理想。 4、进行KLH交联的化学方法 我们用MBS活化KLH，这样能将载体蛋白（KLH）上面的自由-SH与多肽末端的Cys的侧链-SH连接起来，这种方法直接，特异性高，而且稳定，通常选择对免疫不重要的一端进行交联。 EDC活化载体上的-COOH，将载体的-COOH和多肽的-NH2连接起来也是一种可行的方法。但我们只建议在多肽序列中有多个Cys时采用该方法。如果肽链中含有多个-COOH或-NH2基因，不建议使用该方法，因为会造成多重点交联的情况，使多肽结构受影响。常用载体蛋白除KLH外，还有BSA，Ovalbumin等，造成KLH的优势是它不干扰ELISA或Western Blot等实验。 5、对抗原多肽交联合适的肽链长度 通常建议10-15个残基进行交联。肽链越长，抗体识别的区域越多，但也就越多机会形成稳定的二级结构。就不再是天然的形式了。太短的肽通常是没有用的，除非有充足的理由，如与相关家族蛋白或其他蛋白有序列同源性等。 6、KLH交联多肽溶液呈乳状的原因 KLH是一个很大的并且聚合的蛋白。因为它的结构和大小，它在水中的溶解度是很有限的，因此是乳状，这并不影响它的免疫性，这种混浊的溶液可以直接免疫动物。 7、抗体的产量 抗体的产量取决于很多因素：识别区域的选择，多肽的合成，载体的交联，免疫的操作步骤和动物的生理系统等等，因此抗体的产量是不等的。5-25mg都属于正常范围。 |
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