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修饰性肽配体的作用机制、应用及筛选进展
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作者：王青青，杨红振，胡卓伟Acta Pharmaceutica Sinica 2008,43(2):113- 117 图片 摘要： 修饰性肽配体是在抗原表位的基础上对表位进行氨基酸改造形成的具有免疫调节活性的短肽，已经在治 疗自身免疫疾病、恶性肿瘤和病毒感染等疾病方面显示出良好的应用前景。一方面，修饰性肽配体可通过影响天然 抗原表位、主要组织相容性复合体和T细胞受体形成的三分子结构发挥特异性免疫调节作用；另一方面，修饰性肽 配体还可通过改变抗原呈递细胞内信号、旁路抑制和激发异源性免疫反应等机制发挥治疗作用。结合使用噬菌体 展示技术对肽库进行筛选，可获得大量高特异性和高亲和力修饰性肽配体。修饰性肽配体作为潜在抗原特异性药 物的重要来源正在受到广泛关注。 特异性抑制针对自身抗原和变应原的反应性淋 巴细胞功能是防治自身免疫病和变态反应性疾病的 理想方法和最终解决途径，其中治疗性肽疫苗最具 发展前景。治疗性肽疫苗可通过自身抗原T辅助 细胞(T helper Cell,Th)表位代替完整抗原诱导免疫 耐受。在自身抗原表位的基础上，进一步对表位进行氨基酸改造则形成修饰性肽配体(altered peptide ligand,APL)。APL通过与自身抗原天然表位竞争 性结合抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC) 上的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)或T细胞受体(T cell receptor, TCR),发挥特异性免疫调节作用。这种肽疫苗本 身不具有免疫原性，因此与直接应用表位肽诱导耐 受相比更为安全。 APL还可针对肿瘤或病毒免疫显性表位进行修 饰，增加免疫原性，以用于肿瘤和病毒感染性疾病的免疫预防和治疗。本文综述了APL的作用机制、治 疗学应用以及结合噬菌体展示技术进行APL筛选 相关进展。 1 APL 的概念 从广义上讲，APL是指任何受体配基发生一个 或多个氨基酸修饰并导致受体信号功能性改变的肽 段。即使只有一个氨基酸发生变化，也会引起给定 肽段所诱导受体信号和细胞功能发生明显改变，这 种现象为使用APL特异性调节受体功能开启了大 门[1]。 2 APL的作用和机制 2.1 APL对TCR信号的影响 T淋巴细胞能选择性针对病原体产生反应和免 疫记忆，此选择性是基于MHC分子、抗原肽表位 和TCR的特异性结合。如果把MHC和TCR与肽 的相互作用表面看作具有不同大小和电荷的口袋， 那么肽的氨基酸侧链就是填充口袋的最佳配体。通 过内氨酸替代、定向诱变以及肽库技术研究给定肽 段个体氨基酸的功能，表明并非所有氨基酸对受体 功能都具有相同的重要性。采用丙氨酸替代和组合 肽库预测TCR结合显示单一TCR能够识别成干个 不同肽段。假定每一对MHC-TCR组合有一个最佳 配体，那么其他肽段对MHC和TCR的亲和力则较 低。根据激活或抑制T细胞反应的不同参数，TCR 配体可以被分为激动剂、超激动剂、部分激动剂和 拮抗剂。激动剂包括完全激动剂和弱激动剂。完全 激动剂具有高度免疫原性，可诱导给定T细胞所有 功能(包括细胞增生、细胞溶解、细胞因子和趋化 因子释放、表面受体表达上调);弱激动剂也能诱 导完全T细胞活化但反应幅度较弱，且只有在较高 浓度时，才显示出明显作用。超激动剂能够诱导比 最初免疫原性表位更高幅度的T细胞反应[2]。部 分激动剂选择性诱导某些T细胞功能，但不能诱导 细胞增牛。拮抗剂通常不诱导任何特异性功能，但 在与激动剂同时存在时，拮抗剂能与TCR结合，抑 制激动剂的正常刺激功能。 因为大多数TCR属于退化的配基识别，可以和 成千的不同肽段结合，所以针对TCR的APL设计非 常复杂。TCR信号的有效活化不仅与识别的肽段 有关，而目与T细胞相互作用的大量辅助因子有 关。因此TCR对不同肽段的识别以及对T细胞功 能的调节，还有赖于T细胞的活化和分化状态。另 外，T细胞的终末分化情况由未活化T细胞与特殊 抗原第一次相遇和随后的再刺激决定；T细胞的等级性活化由最初条件决定。这些最初条件包括抗原 类型、抗原剂量、免疫途径和频率、佐剂类型、固有免 疫激活程度、宿主的遗传、营养和生理条件等。多种 最初条件之间可发生相互作用，决定已接触抗原T 细胞产生细胞因子的能力，调节不同表面粘附分子 或趋化因子受体表达，因此，最初条件通常促进T 细胞表型移动，而APL却诱导与天然表位肽完全相 反的T细胞表型1。 2.1.1 CD4+T细胞 CD4*T细胞通常用来识别 非自身肽，而改变TCR配体可以改变T细胞反应。T细胞的识别和反应曾经被认为是有或无的反应，但最新研究表明由同一MHCⅡI分子呈递的单一氨 基酸残基发生替换的类似抗原肽或由不同MHCII 分子呈递的同一个特异性抗原肽可表现出有限的多 形性。 重要氨基酸替代可导致T细胞效应的部分或 完全拮抗，因此APL还会影响Th分化方向的改变。根据效应Th细胞产生细胞因子类型的不同，可将其分为Th1、Th2、调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)和Th17等4种细胞亚型。TCR或肽段发生单 一氨基酸变化可改变Th分化方向。例如，TCRα链 互补决定区2中一个氨基酸残基变化导致幼稚CD4 T细胞分化方向从Th1向Th2方向漂移；髓鞘碱性 蛋白(myelin basic protein,MBP)与髓鞘少突胶质细 胞糖蛋白和蛋白脂质蛋白质(proteolipid protein, PLP)被认为是多发性硬化的中枢性自身抗原，也可 通过调节CD4 T细胞极化方向诱导实验性自身免 疫性脑炎(experimental autoimmune encephalomye- litis,EAE);人MBP83-9(ENPVVHFFKNIVTPR-TP) 用丙氨酸替代86位缬氨酸(86A)可产生Th1免疫 倾向；而用丙氨酸替代88位组氨酸(88A)可产生 Th2免疫倾向[3]。 另外，APL还可调节趋化因子和趋化因子受体 表达。接触PLPso-1si的SJL小鼠高表达趋化因子，如巨噬细胞趋化蛋白- 1、巨噬细胞炎症蛋白 (macrophage-inflammatory protein,MIP)- 1α、MIP- 1B、 MIP-2 、fractalkine 以及干扰素诱导蛋白10等，和 Th1相关趋化因子受体，如CCR5和CXCR3;接受 APL动物CCR5和CXCR3表达水平明显降低， Th2 相关趋化因子受体CCR3和CCR4表达增加。以上结果支持APL下调Th1的假设4。 2.1.2 CD4+ CD25+T调节细胞 Treg细胞可抑制Th1和Th2介导的获得性免疫反应并在保持外周 耐受中发挥重要作用。Treg细胞可分为自然发生型(CD4*CD25+Treg) 、适应型、CD4*CD45 Rb{"和 CD4*LAP+Treg等细胞类型。自身免疫性重症肌无 力相关研究表明，具有两个氨基酸改变的双重APL (Lys-262-Ala-207)显著上调细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen, CTLA)4 、CD45 Rb1~ 、叉状头螺旋转录因子( forkhead helix transcription factor,Foxp3) 、细胞内肿瘤生长因 子(tumor growth factor,TGF)- β和neuropilin等表达 水平，诱导CD4 · CD25 · Treg产生[5 。CD45Rb1~ 通过白细胞介素(interleukin,IL)- 10和TGF-B介导 特异性免疫调节作用，可上调细胞内CTLA-4表达， 是潜在的免疫调节靶标；CTLA-4作为负性共刺激因 子，在外周耐受方面发挥重要作用；Neuropilin,一种 轴突导向受体蛋白，与Foxp3共表达，被认为是CD4*CD25*Treg的重要标志之一，并参与下调自身反应性T细胞活性。另外，双重APL还可通过促进 Fas-FasL介导的凋亡下调自身反应性T细胞活性， 逆转实验性自身免疫性重症肌尤力 2.1.3 CD8*CTL 由于具有调节人类免疫缺陷 病毒和黑色素瘤特异性CTL反应功能，APL已应用 于多种自身免疫性疾病的治疗和研究。肽段 SIINFEKL可导致肝内CD8+T细胞缺失，使体内 CTL功能受损[8]。相反，低亲和力肽段G4不会导 致肝内CD8+T细胞缺失，高浓度G4甚至还能阻断 肽段SIINFEKL所致活化CD8+T细胞丢失。 APL还可直接调节细胞毒作用。在没有外界帮 助的情况下，部分激动剂肽段转变为抑制性肽段，失 去刺激特异性CTL增生作用，抑制它们对重复刺激 的反应，诱导非依赖死亡受体凋亡。CTL对病毒或 肿瘤的反应以CTL表位经常突变和功能异常CD4 特异性T细胞反应为特征，部分激动剂的这种生物 学活性改变可能参与CTL对病毒或肿瘤的作用[21。通过改善APL与MHC分子或TCR的亲和力则可诱 导CTL产生9],发挥其抗肿瘤作用。因此通过对以 上效应的分析提示，APL可在改善针对自身免疫性 疾病、病毒、肿瘤的免疫控制以及异种移植排斥方 面[10]提供新的策略。 2.2 APL对APC 的影响 某些APL可以诱导APC细胞内信号改变，导致 随后的T细胞反应也随之发生改变。如TCR-MHC- 肽复合物可通过控制APC产生Ⅱ-12水平决定Th1 分化方向，为Th2相关疾病如过敏性疾病提供治疗 途径。醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)激活树突 状细胞(dendritic cell,DC),通过上调人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)-DR和CD86表达 促进Th2型免疫反应，抑制自身反应性T细胞，减少 IL- 12产生，与干扰素(interferon,IFN)- β协同抑制 多发性硬化患者DC上CD1a表达而增加CD86表达 2.3 APL的旁路抑制 MHC多样性、动物间免疫遗传差异以及感应T 细胞群TCR的广泛多样性是在TCR特异性方式下 使用APL的障碍。然而，动物实验表明APL的效应机制不仅限于对三分子复合物的调节。在复发-弛 张性EAE为特征的SJL小鼠模型中，每一次疾病加 剧过程都伴随主要T细胞反应从一种表型转移为 另一种致脑炎表型转移现象(表位扩展),人体也可 能存在这种机制。基于PLP139-1s1的APL可以预防 免疫显性致脑炎原PLP139-151以及随后表位扩展为 PLPrg-101的反应，其至可以预防鼠MBP诱导的疾 病。这是因为它能够有效激活APL特异性的免疫 调节性T细胞，促进这种免疫调节T细胞迁移到炎 症部位，通过与组织损伤过程中释放的天然抗原交 叉作用，诱导产生炎症因子，如I4、IL-10、IL-13和 TGF- β等[21。释放的这些炎症因子随后通过抗原 非特异性方式下调正在进行的免疫过程，这种调节 机制被称为旁路抑制。 2.4 APL异源性激发特异性免疫反应 APL可诱导异常免疫反应。APL免疫小鼠后， 在体外用天然非最佳配体扩增APL特异性T细胞， 导致可识别APL的高功能性、高亲和力T细胞扩 增。这种现象是由于单一肽免疫诱导不均一和多克 隆T细胞反应；反应细胞的选择性不是随机的，只 有预设敏感性阈值的T细胞能够有效地从T细胞 池里面扩增出来。调节免疫肽的剂量可以扩增完全 不同的T细胞池：从胸腺负性选择中逃脱进入外周 的自身反应性T细胞，其TCR与自身抗原的亲和力 通常较低，它们只被很高浓度的APL或天然配体激 活和扩增；而能够识别隐藏表位具有高度亲和力的 T细胞群进入外周被APL激活，可导致异常免疫反应，识别天然抗原，使自身免疫过程永存。增加APL 免疫原性及其与天然肽之间的交叉反应或其异源性 激发特异免疫反应功能在疫苗设计中具有重要意 义[13]。 3 APL的治疗学应用 APL能有效治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA) 、1型糖尿病、重症肌无力、 EAE等多 种自身免疫病，然而动物模型与相应的人类疾病存在某些差异[1]。首先，致病自身抗原不同。动物模 型中自身抗原是已知的，可诱导疾病发生。不同致 病自身抗原在不同动物品系具有不同致病潜力。例 如，对于以复发-弛张性EAE为特征的SJL小鼠， PLP39- 1s1是显性致脑炎因子， PLP178- 191和MBP84- 10 是低致脑炎因子；对于PL/JxSJL/JHI小鼠， MBP87-99 是致脑炎因子。然而，对于特定人类自身免疫病患 者而言，研究者还无法确定哪一个候选自身抗原具 有致病性，并有可能出现表位扩展。其次，自体反应 T细胞功能状态不同。动物自身免疫病是通过主动 免疫或被动导入自体反应T细胞形成的。自体反 应T细胞在有限数量活化后处于未成熟或早期效 应状态。但是，在人类自身免疫病诊断或治疗选择 的时候，其自体反应T细胞可能已经经历了多次活 化循环，有的甚全已经形成终末分化效应细胞或记 忆细胞。再者，免疫遗传背景存在多样性。自身免 疫病动物模型是在特定的品系上建立的，不同品系 MHCII表型不同对疾病的易感性也不同，如小鼠 MHCⅡI编码区域主要是IA和IE两个等位基因；而 人类可表达8个以上MHCⅡI等位基因。另外，APL 的安全性是必须考虑的问题。APL的保护性效应即 使在很好的确认系统下也仅仅是66%;APL单独免 疫动物时，1%的动物会形成EAE,提示APL治疗本 身存在一些比较低的诱导疾病的危险。 近来，APL在治疗变态反应性疾病[41、人类 RA、银屑病、1型糖尿病和多发性硬化等方面取得 了良好的进展。例如，含有TCR接触残基的多个 氨基酸替代的胶原Ⅱ( collagen Ⅱ,CⅡI)263-22衍生肽 段，可剂量依赖性抑制天然抗原CII263-27诱导的T 细胞活化，同时抑制Thl细胞因子分泌和细胞表面 标志分子表达[15]。角质素17修饰肽119R和355L 可抑制银屑病患者T细胞增殖，降低IFN-y和IL-2 水平，增加I4、IL-10、TGF- β水平，增强Th2型 免疫反应，抑制角质化细胞增生[16]。胰岛素B链 氨基酸9-23肽段是1型糖尿病患者IFN- γ产生的 Thl淋巴细胞识别表位，对其进行修饰得到的NBI- 6024具有免疫调节作用，可显著增加I-5分泌。I 期临床实验结果也支持其保护性Th2调节作用。目 前已进入Ⅱ期临床研究[17]。 最近有报道表明流感病毒凝血素(influenza virus haemagglutinin,HA)衍生肽段可以抑制RA患 者HLA-DR4/1特异性肽段所致T细胞活化[]。修 饰性HA3o8-317肽段与细胞表面HLA-DR4/1结合的 能力比CII263-22高，可阻断HLA-DR4/1与其他抗原肽结合从而取消HAao8-317或CI263-22所致T细胞增 生和CD25表达，提示APL具有潜在的RA治疗作 用 。 4 噬菌体展示技术在APL筛选中的作用 大多数生物药物通过作用于蛋白靶点、改变蛋 白和细胞行为发挥作用。通过噬菌体展示技术发现 的、与蛋白靶点具有高亲和力和特异性结合的肽，具 有制造费用较低、活性较高(15～60倍)、知识产权 壁垒较少、稳定性较高、与免疫系统发生不相关相互 作用的机会较少、器官和肿瘤穿透性较好等优点，甚 至可以和抗体相媲美,成为生物制药中一种可靠替代品。 噬菌体肽库包含1×101°个由10～50个氨基酸 组成的肽段(远远超过组合的小分子库),而且含有 组合的残基(即在可变的残基上增加结构),能够快 速提供结合于靶蛋白不同部位的成百结合物。目前 大多数治疗肽都是激动剂，但是在肿瘤和炎症治疗 中，能阻断参与疾病进程活化受体的阻断剂引起人 们的重视。通过噬菌体展示既可以得到作用增强的 肽，如可在体内产生长期细胞毒作用的CTL表位 肽[1],也可通过控制肽和靶点相互作用的长度和内 容得到阻断蛋白之间相互作用的肽[20]。 另外，TCR是获得性免疫系统中除抗体外仅有 的抗原识别分子。高亲和力TCR具有特异性高、副 作用较小等特点，可成为新的治疗靶点，天然亲和力 较低是其主要缺点。通过噬菌体展示技术可以使 TCR的亲和力提高白万倍。例如，通过噬菌体展示 技术可获得与细胞表面的肽-MHC复合物高特异性 和敏感性结合的TCR[21]。此外，Dunn等[2]还得到 了亲和性增加、没有明显交叉作用的人类TCRCDR2 残基。 5 结语 APL能特异性地针对自身抗原和变应原表位进 行修饰，代替完整抗原实现免疫耐受；可针对肿瘤或 病毒免疫显性表位进行修饰，增加其免疫原性，作为 肿瘤或感染的多肽疫苗；还可通过阻断参与疾病 (如肿瘤和炎症等)进程的活化受体，产牛与封闭 肽[23]相似的治疗作用。尽管APL的作用机制需进 一步研究，但由于其抗原特异性治疗的特点，APL仍 然得到了临床医生和科学家的广泛关注。而且，随 着噬菌体展示技术在肽药物筛选中的应用，APL有 望成为新一代药物的重要来源。APL相关作用机制 研究也有利于研究者对疾病发展和机制的深入认识 及克服疾病治疗过程中遇到的困难。 免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可联系删除 |
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