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【实验方法】明胶酶谱法检测 MMP 活性
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细胞外基质（ extracellular matrix ， ECM ）是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以降解细胞外基质成份，需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子，是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶。基质金属蛋白酶2（MMP2）主要降解IV型胶原，基质金属蛋白酶9（MMP9）可以降解弹性蛋白、胶原蛋白、明胶和纤维蛋白等细胞外基质的成分。基质金属蛋白酶的失调是多种疾病发生、发展的重要机制之一。 明胶酶谱实验可以检测MMP2和MMP9的活性，是分子生物学的常用实验技术之一。先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 实验流程如下： 图片 No.1 样品制备 组织或细胞的蛋白样品制备可用常规的方法，但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA，因为EDTA是金属离子螯合剂，可以络合Zn2+，抑制MMP的活性；也不能加入β-巯基乙醇或DTT，因为会导致蛋白的二硫键被打开，蛋白不能复性。推荐用PBS或Tris缓冲液（pH7.5）作为蛋白提取的缓冲液，可以加入0.5%的PMSF。 No.2 SDS-PAGE 1)SDS-PAGE 凝胶配制 _ 10%分离胶 5%浓缩胶 总体积 10mL 6mL 30%丙烯酰胺 2.0mL 0.75mL 1.5M Tris-cl (PH 8.8) 2.5mL / 1.0M Tris-cl (PH 6.8) / 0.76mL 10%SDS 0.1mL 0.006μl 10%AP 0.1mL 0.006μl TEMED 8μl 0.006μl 明胶（10mg/mL） 1.0mL / 超纯水 4.5mL 4.5mL 明胶母液配制后可在4℃保存，最好不超过1周。 2)电泳 4℃、常规电泳即可，可以适当延长电泳时间，至溴酚蓝完全出胶。上样量一般为50μg，可根据实验的具体情况和预实验结果调整。 注 意 ①上样缓冲液中不能加入β-巯基乙醇或DTT，原因同上。 ②样品与上样缓冲液混合后直接上样，样品不要煮沸，高温会导致蛋白不可逆的失活。 No.3 反应和显色 1)将凝胶置于洗脱液（2.5% Triton X-100，50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH7. 6）中振荡洗脱2次,每次40分钟。 2)漂洗液（50mM Tris-HC，5mM CaCl2，1μM ZnCl2）漂洗2次,每次20分钟。 3)凝胶置于孵育液（50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.02% Brij-35）中37℃ 孵育42-48小时。 4)染色液（考马斯亮蓝染色液）染色3小时。 染色液配方表 甲醇 乙酸 5%浓缩胶 30% 10% 0.5% 5)脱色液A、B、C分别脱色（脱色液配方及时间见附表）。 脱色液配方及脱色时间 _ 甲醇 乙酸 脱色时间 A 30% 10% 0.5小时 B 20% 10% 1小时 C 10% 5% 2小时 脱色时间可以根据观察到的脱色效果调整。 |
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