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信号肽优化对重组抗体分泌表达的影响及研究进展
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作者：陈龙冠,覃锦红,黄云娜,麦俊新,谢秋玲. 中国生物工程杂志, 2016, 36(3): 77-81 摘要: 重组抗体药物在抗肿瘤、抗自身免疫病、抗感染等领域都有较好的应用前景,且市场的需求量正在逐年上升。然而许多的抗体药物在研究、生产过程中都面临着产量低、稳定性差、活性低等问题。目前,在大规模制备抗体药物的过程中,常常利用动物细胞表达系统来生产分泌蛋白,而信号肽作为连接在分泌蛋白N端的一段氨基酸序列,能够控制蛋白质的分泌途径进而影响抗体蛋白的表达产量。简要概述了信号肽的一级结构与作用机制,同时,指出其对重组抗体蛋白分泌效率的影响途径,最后结合各种研究成果总结出信号肽序列优化策略。 蛋白质在细胞内的表达形式主要有三种，包括经典的内质网高尔基体途径分泌到细胞外、以可溶性蛋白留在细胞内、以不可溶包涵体的形式留在细胞内。在目前的抗体蛋白生产中，主要使用的表达方式为胞外分泌，因为分泌出细胞外的抗体不仅能以可溶性的活性结构生产，避免细胞内酶蛋白的降解，同时也有利于下游的纯化，降低复性的困难[1]。但在实际生产中，不仅常遇到所构建载体的抗体蛋白不分泌或分泌量低等问题，而且也会出现所得抗体稳定性差、活性低等急需解决的问题。其中一个解决方法就是通过融合一个合适的信号肽到目标抗体的基因序列5′端。抗体的重链和轻链均需在信号肽的作用下进入内质网完成正确折叠和组装，才能以有活性的形式分泌到胞外[2]。一般情况下，重组抗体的基因序列自身就带有一段信号肽序列用于自身的分泌，但是在大多数情况下重新构建的表达载体不能或低效率的利用抗体本身的信号肽序列，这时就需要重新筛选或对原有信号肽进行优化，可以达到提高重组抗体的分泌效率的目的。 1 重组抗体的研究进展 抗体药物的发展经历了鼠源单克隆抗体(McAb)、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体等阶段，在抗肿瘤、抗自身免疫病、抗感染及生物传感器等领域都具有较好的应用前景。随着分子机制的深入发掘和抗体基因结构的阐明，利用基因工程重组抗体蛋白、构建抗体药物偶联物及哺乳动物细胞大规模培养等生产技术推动抗体工程进入了一个全新的时代。统计发现，2010 年美国市场的单抗药物销售额为 185 亿美元，世界范围内单抗药物销售额总计已达 400 多亿美元，约是整个生物制药市场份额的 36%[3]。发展至今，抗体药物的生产主要通过基因工程的方法构建体外表达载体来实现大规模生产的要求。由于重组单克隆抗体需要进行翻译后修饰(如糖基化修饰)、折叠及正确的切割或至少与人体内获得的相似，才能产生有活性，且降低免疫原性和细胞毒性的抗体药物，因此一般需要在哺乳动物细胞(如CHO)中大量生产[4, 5, 6]。与大肠杆菌相比，CHO等哺乳动物细胞的表达水平低、细胞大规模培养的成本高，由此导致所生产的蛋白质药物成本较高。因此，设计与优化体外表达载体是提高目的蛋白表达量的重要途径之一，具体表现为将编码细胞生长刺激因子、抗凋亡因子及其他细胞生长必需成分的基因加入表达载体，进而敲入宿主基因，也可以通过在抗体信号肽基因3′端下游增加可供肽酶识别的位点，达到提高蛋白质分泌效率的目的[7]。常见的哺乳动物商业化表达载体有pTandemTM、pTK-neo (Novagen)等。 2 信号肽结构及转运机制 Gunter Blobel 于20世纪70年代初提出了“信号假说”用以解决蛋白质合成后的去向问题[8]。高等动物体内大多数分泌型蛋白通过 N 端的一段由15~30个氨基酸组成的与蛋白质的分泌密切相关称之为信号肽的氨基酸序列启动经典的内质网高尔基体途径进行分泌表达[9]。信号肽具有引导前体肽进入粗面内质网内且通过分泌途径分泌出胞外的作用。 2.1 信号肽一级结构 信号肽位于分泌蛋白的N端，一般由10~40个氨基酸残基组成，并大致分为3个区段：①n区(n-region)为带正电荷的氨基酸，如赖氨酸和精氨酸；②疏水区(h-region)由9个或更多的以中性氨基酸为主组成的疏水核心区，能够形成一段L螺旋结构，常见有亮氨酸、异亮氨酸等；③加工区(c-region)是信号肽酶切割信号肽的部位，由极性、小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等)组成。一般认为疏水区氨基酸序列越长、疏水性越强的蛋白质分泌效率就越高，因此疏水区的长度及疏水性对蛋白质分泌十分重要[10, 11]。信号肽结构如图 1所示。 图片 图 1 信号肽一级结构(n区-h区-c区)[12] 2.2 信号肽转运机制 信号肽介导的蛋白质转运可分为两大类: 若某个蛋白质的合成与转运是同时发生的,则属于翻译-转运同步机制; 如果蛋白质从核糖体上释放后才发生转运,则属于翻译后转运机制。 (1)翻译共转运途径[13]。核糖体串联成聚核糖体，准备合成蛋白质→信号识别颗粒(SRP)识别并结合在核糖体上→在聚核糖体上，由mRNA开始合成信号肽→SRP识别信号肽并与之结合，多肽链合成暂时停止→SRP-信号肽-聚核糖体复合物与内质网膜上SRP受体及核糖体受体结合→暂时停止合成的多肽链恢复合成，新生肽链随信号肽延伸，接着信号肽被膜内侧的信号肽酶水解，新生肽链继续延伸，形成有高级结构的成熟蛋白质。翻译共转运途径如图 2所示。 图片 图 2 翻译共转运机制流程 (2)翻译后转运机制。特定条件下蛋白质在其合成结束后才开始转运,采用这种机制定位的蛋白质一般都是可溶性蛋白质,它们有一段适度疏水的信号肽序列而使它们在合成时避开了 SRP 的识别。 3 信号肽对抗体蛋白分泌效率的影响 3.1 一级结构氨基酸组成 大量研究表明，对于动物细胞而言，信号肽的疏水核心长度和疏水性对于抗体蛋白的分泌效率至关重要[14, 15]，强疏水性能够高效引导新生肽的转运。有研究表明，在对全球热门抗体药物阿瓦斯汀(Avastin)的重链信号肽疏水核心区进行一级结构改造后，用新的疏水性较低的信号肽取代原有信号肽，由此造成阿瓦斯汀产量降低[16]。此外，研究酵母 PhoA 信号肽疏水核心Leu与Ala 的比值时发现，当 Leu／Ala 为 6∶4 时，前体蛋白分泌加工能力最高，在此比值附近，信号肽分泌加工能力随疏水性的增强而提高[17]。 3.2 二级结构的空间构象 信号肽序列的二级空间构象能够与mRNA翻译起始因子相结合，但过于复杂的二级结构却会引起翻译阻遏效应。研究表明，全人源化抗HBsAg抗体的原信号肽经过优化后二级结构能量从原来的ΔG=－19.7kcal/mol降至ΔG=－15.9kcal/mol，最终优化后的轻链信号肽序列蛋白质表达量比原轻链信号肽序列表达载体高4~8倍[18]。 4 信号肽序列优化策略 研究发现，许多原核和真核细胞甚至不同物种间的信号肽在功能上是通用的，国外进行基因表达所采用的分泌信号大致有以下几种情况:①与表达蛋白质同源的分泌信号肽;②与宿主表达细胞同源的分泌信号肽;③机体内表达的分泌蛋白的分泌信号肽。不同物种间的信号肽都可以用于某一特定宿主细胞表达系统中表达免疫球蛋白[19]。在动物细胞表达系统中表达重组抗体蛋白时常用到的信号肽除了自身所携带的信号肽还包括：①替换高效表达蛋白质的信号肽序列作为重组抗体的信号肽，如乳蛋白中的酪蛋白或血清白蛋白的信号肽序列等，因为这些蛋白质能在细胞中被高效分泌；②对原有抗体信号肽序列进行一级结构改造；③替换某些病毒的蛋白质信号肽序列。 4.1 替换高效分泌蛋白的信号肽 当所构建的细胞株无法利用自身的天然信号肽获得高表达分泌目标抗体时，利用高表达蛋白质的信号肽替代原信号肽可以提高目标抗体的表达量，往往同一物种的信号肽比其他物种的信号肽表达量要更高[7]。研究表明，α因子信号肽对引导小分子质量的蛋白的分泌很有效，如表皮生长因子，单链抗体Fv片段等利用α因子信号肽获得了较理想的表达量。Lars等[20]应用CHO细胞证明，与来自不同物种的或天然免疫球蛋白G信号肽衍生的信号肽相比，白蛋白和天青杀素的天然信号肽介导了抗体的最佳表达。 4.2 改造信号肽一级结构 信号肽一级结构中存在3个功能区，根据研究报道，增加芽孢杆菌信号肽N端的正电荷或增加信号肽疏水核心h区的疏水性或长度有利于提高信号肽的加工效率，信号肽C端氨基酸残基的缺失使H区更靠近切割位点，可能有利于蛋白质的易位；而增加信号肽C端的极性，则可能会使信号肽的空间结构发生变化，降低其加工效率[21]。 4.3 考虑宿主密码子偏爱性 编码同一种氨基酸的密码子称为同义密码子，蛋白质合成过程中，同义密码子的使用概率并不相同，某一物种或某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义密码子，即为密码子的偏爱性[22, 23]。各种生物的密码子使用并不是随机的，而有一定的偏爱性,在选择信号肽时，应考虑到该表达宿主相应的偏爱密码子，再进行信号肽的优化。Valent等使用偏爱密码子的信号肽所得目标蛋白产量更高，稳定性也较天然信号肽好[23]。Jalah等对1L-15的天然信号肽进行优化时，联合使用偏爱密码子，使得1L-15的表达水平提高了近100倍[24]。 4.4 使用某些病毒表达载体所带的信号肽序列 某些病毒的表达蛋白是高分泌蛋白，如昆虫杆状病毒表达载体和丙型肝炎病毒系统表达外源基因的表达量高，而且能完成真核基因产物必要的转录后加工修饰[25]。但是在表达抗体药物时一般不会使用病毒载体，因为其安全性无法得到保障。 5 小 结 基于信号肽的功能对重组抗体分泌具有重要的作用，对于其的应用也越来越广泛。通过添加一段合适的信号肽序列来引导重组抗体的分泌不仅可以实现提高分泌效率和简化下游的纯化过程，而且对抗体的稳定性和活性都具有积极的作用，当然信号肽序列的选择和优化要根据不同的蛋白质及表达系统来进行。目前，高效的信号肽也正在不断被研究和挖掘出来[26]。另外，可以利用在线工具进行查询和检测信号肽序列，从基因组中快速地预测出信号肽[27]，结果的可信度也比较高。例如，使用UTR Tailortech库和SignalP及Tatp软件等来预测筛选适合目的蛋白最佳分泌效率的信号肽[28, 29]。 展望未来，随着抗体药物的发展和进步，关于提高重组抗体的表达量和稳定性的研究会不断的深入和发展，方法也会越来越多，而基于信号肽优化的方法或策略将会很好地促进上述研究。 免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可联系删除 |
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