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抗菌肽来源、分类方式、生物学活性、作用机制及应用研究进展
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作者：刘秀，郭中坤，王可洲Chin Med Biotechnol, December 2016, Vol. 11, No. 6 近年来，抗生素的滥用引发大量耐药菌株产生、抗生素疗效下降等一系列问题，严重威胁着人类和动物的健康。作为抗生素的一类可能替代物，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）具有广谱抗菌活性，对部分病毒、寄生虫、肿瘤细胞等也具有抑杀作用，且不易产生耐药性，在医学、兽医学和生命科学等研究领域有着良好的应用前景。本文从抗菌肽的来源、分类方式、生物学活性、作用机制和应用研究等几个方面，综合阐述了国内外关于抗菌肽的研究动态。 抗菌肽又名抗微生物肽，是生物机体天然免疫系统的重要组成部分，是一类在自然界生物中广泛存在的，分子组成通常小于 100 个氨基酸，具有抗细菌、抗真菌等多种生物学活性小分子多肽的统称[1-2]。1972 年，瑞典学者 Boman 等[3]在对果蝇的相关研究中首先发现并报道了一类有抗菌活性的多肽分子。随后，研究人员从经大肠杆菌刺激的惜古比天蚕中获得第一种真正的 AMPs——天蚕素（cecropin）[4]。资料显示，截至目前，文献已报道的 AMPs 多达 2000 余种。 研究表明，多数 AMPs 不仅对细菌、真菌和抗寄生虫具有一定的抑制作用，而且对包膜病毒、肿瘤细胞也有一定的抑杀作用，具有较广的生物学活性，且不易引发相应的耐药性[5]。因此，AMPs 被誉为“天然超级抗生素”。 1 天然 AMPs 的来源 自 20 世纪 70 年代以来，相关学者相继在昆虫、甲壳动物、软体动物、两栖动物、哺乳动物、人、植物等生物体内研究发现类似的具有抗菌活性的多肽。 1.1 植物来源 AMPs 由于植物不具备哺乳动物机体内的特异性免疫系统，在其生长过程中遭受病原微生物侵袭时，非特异性免疫防御系统的作用显得尤为重要[6]。而 AMPs 就是该系统发挥防御作用的一类重要分子。植物机体在遭受生物侵袭或非生物条件刺激时，能迅速产生一类对入侵病原生物具有抑制或杀灭作用的活性成分——AMPs[7]。据报道，相关学者根据氨基酸序列及其二级结构的不同，将植物源 AMPs 分为 9 类：包括硫素、植物防御素、转脂蛋白、橡胶素、打结素、凤仙花素、荠菜素、蜕皮素和环肽[8]。 1.2 动物来源 AMPs 动物源 AMPs 是动物免疫防御系统的重要组成部分，是动物机体为应对外源性病原体的致病作用，在外界条件诱导下产生的免疫防御性活性成分。作为天然免疫系统的重要效应分子，动物源 AMPs 除担负着广谱抗菌职能之外，在体内还发挥着多种多样的免疫调节作用，又被称为宿主防御肽。根据其物种来源，动物源 AMPs 可被分为无脊椎动物源和脊椎动物源 AMPs 两大类[9]。 1.2.1 无脊椎动物源 AMPs 无脊椎动物种类繁多，约占动物物种种类总数的 95%；而昆虫即为其中的第一大类。而且由于昆虫对外界的环境具有极强的适应性和防御能力，在世界上的分布也最为广泛。昆虫 AMPs 是昆虫在受到外界刺激或感染后，由体内血淋巴细胞合成分泌的一类具有分子量小、易合成、不易形成耐药性等特点的小分子碱性多肽[10]；该类碱性多肽对多种致病菌、真菌、病毒等均有抑杀作用，但不会对生物体的正常细胞造成破坏[11]。资料显示，截至目前，被报道的昆虫 AMPs 已有 200 余种。根据其氨基酸序列和结构特点，将昆虫 AMPs 主要分为分子内二硫键类、富含甘氨酸类、富含脯氨酸类和 α 螺旋两性分子类[2]。 1.2.2 脊椎动物源 AMPs Cathelicidins 和防御素是迄今为止在哺乳动物体内分离获得的主要的两大类 AMPs[12]。其中，脊椎动物 cathelicidins 家族 AMPs 的抗菌谱更广、抗菌活性更高，且细胞毒性较低，不易引发机体细胞的溶血，在新型抗菌药物研发领域中具有广阔的应用前景[13]。防御素是天然免疫系统中具有广谱抗菌活性的一类重要组成部分，在人类 AMPs 中的种类也最为丰富。近年来，随着生物信息学和分子生物学技术的广泛应用，研究人员在对多种动物基因组测序和分析中发现并报道了大量新型 AMPs。目前，学者仅在猪体内发现的具有明确序列的 AMPs 已达30 余种；实验表明，这些 AMPs 均具有良好的免疫调节功能和广谱抗菌活性，但对真核细胞没有毒性或具有较弱的细胞毒性[14]。在许多无尾目类动物（青蛙和蟾蜍）的表皮分泌物中，也发现了丰富的具有广谱抗菌活性的多肽[15]。 1.3 微生物来源 AMPs 目前，微生物来源 AMPs 被学者分为源自细菌的AMPs——细菌素（bacteriocins）和源自病毒的 AMPs 两大类。细菌素是一类由 G+ 和 G- 细菌核糖体合成的具有抑菌活性的小分子多肽，在各种环境条件下和细菌的各个生长阶段均能发挥抗菌作用。研究表明，微生物来源的 AMPs 的种类和数量相对较少，且细菌素的种类多于病毒来源的AMPs。G+ 菌可产生糖肽、脂肽和环形肽等典型窄谱AMPs，如乳链菌肽、多粘菌素、杆菌肽等；其中，短杆菌肽 S 和多粘菌素为一类带有高正电荷的两亲性 AMPs[16]。据报道，多粘类芽孢杆菌 CP7 菌株能够产生包括抗 G+ 菌的 cpacin 抗菌肽在内的多种抗菌活性物质，是一种具有广谱抗病原菌活性的拮抗性细菌[17]。资料显示，目前已发现病毒源 AMPs 种类相对较少。其中，慢病毒跨膜蛋白的 C-端富含精氨酸的 AMPs 为一种具有抗菌活性和细胞毒性的强两亲性多肽[18]。源自丙型肝炎病毒（HCV）NS5A 的 α 螺旋肽（C5A）可以使其在细胞外和细胞内感染颗粒失活，对 HCV 的从头感染及其进行性感染具有阻碍和控制作用[19]。 1.4 人工合成抗菌蛋白 资料显示，尽管天然 AMPs 在多种动物的特定组织中广泛存在，但含量较低，化学合成成本又较高，制约着 AMPs 进一步的开发和应用。随着基因工程技术的成熟和发展，采用基因工程手段实现重组 AMPs（rAMPs）的生物合成正逐渐成为抗菌蛋白研究的重要途径之一。近年来，相关学者借助计算机生物信息预测等相关软件辅助技术，设计和优化抗菌蛋白编码序列，获得一系列改良型重组抗菌肽/抗菌蛋白，并在临床试验中逐渐应用开来[20]。杨丽敏等[21]采用 Java 技术，对 NCBI 中已有的 AMPs 序列重新进行剪接，并利用计算机技术对获得的新型 AMPs 的活性和功能进行模拟预测，大幅降低了天然抗菌肽/抗菌蛋白的改造成本。为解决部分 AMPs 空间结构不稳定和具有溶血活性等相关问题，研究人员尝试通过替换 AMPs 分子内的部分氨基酸、改造其分子结构等方法进行相关试验研究，以增强其抗菌活性、减少其免疫反应。Hicks 等[22]研究发现，一些含有由两种非天然氨基酸四氢异喹啉羧酸（Tic）和八氢吲哚-2-羧酸（Oic）组成的二肽单元肽链能与细菌细胞膜的不同组成部分相结合，从而发挥较强的杀菌效果。另有研究发现，改变 AMPs 中某些氨基酸的含量也能进一步增强 AMPs 的杀菌活性，并且还有一定的降低溶血反应的作用[23]。 2 AMPs 的分类方式 AMPs 在分布、结构和生物学活性等方面存在着多样性，因此人们可采用多种分类方式对其进行分类。第一种，根据 AMPs 的来源不同，将其分为动物源、植物源和微生物源 AMPs；第二种，根据其作用对象不同，将其分为抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等 AMPs；第三种，根据其所含氨基酸的种类不同，将其分为富含脯氨酸残基的蛙皮素（magainin）、天蚕素，富含 Cys 残基的防御素和富含 Gly 残基的蜂毒素（melittin）[24]；第四种，根据 AMPs 的空间结构和氨基酸组成，将其分为 α 螺旋、β 折叠、富含 Cys 残基或其他某些规则氨基酸残基的 AMPs[25]。其中，α 螺旋AMPs 的分布最为广泛，受到研究人员的密切关注。 3 AMPs 的生物学活性 AMPs 结构的多样性从某种程度上决定了其生物学活性的多样性。研究表明，AMPs 不仅对 G+ 细菌和 G- 细菌具有较高的抗菌活性，而且对部分真菌、病毒、肿瘤细胞和原虫等也具有一定的选择性杀伤作用；但其对正常的哺乳动物细胞未见有明显毒副作用[26]。 3.1 广谱抗细菌活性 研究表明，在琼脂糖弥散法抑菌活性测定试验中，AMPs 可同时抑制一种或多种混合常见 G+/G- 细菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等）生长[27]。AMPs 拥有比传统抗生素抗菌谱更广的抑菌活性，引起了研究人员越来越多的关注。资料显示，兔肠源抗菌蛋白对 9 种测试菌株的杀菌率为 78% ~ 98%，具有较强的抗菌效果[28]。王炜和任伟宏[29]在对天蚕素多肽分子生物活性的研究中发现：天蚕素多肽分子可有效抑制标准大肠埃希菌株（ATCC25922 株）及多重耐药菌株（临床分离株）的生长；尽管天蚕素多肽分子对大肠埃希菌多重耐药菌株（临床分离株）的抑制效果相对较弱，但其抑菌活性可保持 10 h 以上，有效持续时间比多种抗生素更长。研究表明，鸡源 Fowlicidin-3 AMPs 酵母重组表达产物对致病性大肠杆菌 K99、鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌 Cowan I 等均具有抑杀作用[30]。 3.2 抗真菌活性 AMPs 不仅对细菌具有广谱抗菌的作用，对一些真菌也有一定抑杀作用。Fehlbaum 等[31]从果蝇中分离出与富含Cys 的 AMPs γ-thionins 及 Rs-AFP II 具有高度同源性的抗真菌肽 drosomycin，但试验结果表明 drosomycin 不能有效抑制细菌和酵母菌的生长。此外，已发现的还有东北大黑鳃金龟幼虫抗真菌肽 holotricin III[32]、鳞翅目昆虫抗真菌肽heliomicin 和白蚁死亡素 termicin 等[2]。另有资料表明，某些昆虫源 AMPs 不仅可有效防治某些特殊植物性真菌病，还可以使某些谷类作物的产量增加。 3.3 抗病毒活性 目前临床应用的抗病毒药物均有不同程度的毒副作用，寻找更加安全且有效的抗病毒药物是研究人员长期关注的焦点。研究表明，目前研究中发现的大多数 AMPs 对包膜病毒的杀灭效果优于无包膜病毒[32]。资料显示，哺乳动物defensin 家族和两栖动物 magainin 家族、brevinin-1 家族、maximins 家族等 AMPs 对单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒等包膜病毒均有一定灭活作用[33]。有研究表明，重组表达的 α 防御素和 β 防御素，对包膜和非包膜病毒均具有抗病毒活性[34]。 3.4 抗肿瘤活性 鉴于 AMPs 具有理化性质稳定、抗菌谱较广，且不易引发细菌产生耐药性等优点，相关学者对 AMPs 的早期研究主要致力于将其开发为新一代高效抗菌药物。近年来，随着人类对 AMPs 逐步地研究和探索，一些 AMPs 在体内和体外的试验中所表现出的抗肿瘤活性引起国内外专家学者的日益关注。人们在肿瘤治疗的研究中发现，多数化疗药物在消除癌细胞的同时也会对正常细胞造成一定程度的损伤，具有较强毒副作用。研究表明，从果蝇幼虫中分离获得的富含甘氨酸的抗菌肽 SK84 对多种癌细胞系（人白血病THP-1、肝癌 HepG2 和乳腺癌 MCF-7 细胞）的增殖均有特异性抑制作用，且无溶血活性[35]。这表明，AMPs 不仅可以特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长，而且不会损伤机体的正常细胞。因此，AMPs 在今后的研究中有可能成为一种新型的抗肿瘤药物。 4 抗菌作用机制 近年来，相关学者针对 AMPs 的抗菌机制开展大量研究，但仍未能完全阐明。研究资料表明，AMPs 对微生物的广谱抗菌作用可能与其对细胞膜通透性、核酸复制及蛋白质等物质的生物合成有关。 4.1 对细胞膜的作用 研究表明，阳离子 AMPs 通过静电相互作用先结合在表面带负电荷的细胞膜上，破坏细胞膜的完整性并诱使其产生孔隙，致使细胞的内容物外溢而死亡[24]。破膜型 AMPs的作用机制假说主要有以下三种：环孔模型、毡毯模型和桶板模型[36]。第一种，环孔模型。AMPs 垂直插入磷脂双分子层内，并始终与其磷脂头部相结合，共同形成环孔形跨膜通道，破坏细胞的跨膜电位和渗透调节功能，抑制细胞的呼吸作用，最终导致菌体死亡。第二种，毡毯模型。由于 AMPs 分子具有水脂两亲性，可与磷脂双分子层的磷脂“头”部结合，且亲水性朝向水溶液，致使 AMPs 以与毡毯类似的结构平行地排列在磷脂双分子层表面，待 AMPs 达到临界浓度时，磷脂双分子层稳定性降低，内外受力不均而变形，最终导致细胞膜破裂[37]。AMPs 对革兰阴性菌和寄生虫的作用多属于此类机制，如抗菌肽 aurein 1.2，人类 cathelicidin 衍生LL37、爪蟾丙氨酸取代 magainin-2 酰胺、uperin-3.1 和cecropin-LL37 混合物抑制牛痘病毒的过程符合该模型[38]。第三种，桶板模型。AMPs 借助疏水作用力在细胞膜表面富集，通过改变磷脂双分子层构象形成 AMPs 多聚体，垂直插入细胞膜的磷脂双分子层中；AMPs 的疏水部分与双分子层内部相互作用，亲水部分朝向细胞内部形成孔隙或通道。由于此类模型的排列与水桶上的木排形状相似故被命名为“桶板模型”。从青蛙的皮肤分泌物中分离出的抗菌肽Ctx-Ha 就是基于桶板模型的作用机制[39]。 4.2 对核酸生物合成过程的作用 AMPs 发挥抗菌作用另一种可能机制是抗菌物质进入胞内，作用于基因组，从而引起细胞结构功能的破坏而导致细菌死亡。苑园园等[40]在多粘类芽孢杆菌 CP7 菌株的抗菌蛋白（CP7ACP）对嗜水气单胞菌 S12 菌的生长、细胞结构、生物大分子和磷泄漏影响的研究中发现，CP7ACP 能使嗜水气单胞菌 S12 菌细胞壁、细胞膜、细胞器以及菌体均受到不同程度的破坏，致使胞内磷和生物大分子发生明显外泄，S12 菌基因组 DNA 呈现增色效应。此外，鲎素可通过基因组 DNA 和 RNA 结合，阻碍相关基因的转录。猪小肠抗菌肽 PR-39 可以通过阻止蛋白质的生物合成，诱导在 DNA 复制过程中的关键蛋白质降解，从而抑制细菌的繁殖生长[41]。 5 AMPs 的应用 5.1 AMPs 在畜牧业生产中的应用 近年来，由于抗生素类药物在动物饲料生产中的过度添加和使用，破坏了机体肠道正常微生物种群的平衡，并在动物性产品和环境中出现大量药物残留，致使致病菌的耐药性不断产生、畜禽机体的自身抵抗力下降等问题日益严重，给畜产品的质量和人类的健康带来了严重威胁。为解决面临的上述问题，尝试将 AMPs 作为新一代抗生素的理想替代物，添加至畜禽饲料中的研究越来越多。研究表明，用天蚕素代替抗生素饲喂雏鸡，可以明显提高雏鸡的日均增重量和机体发育早期免疫器官的重量指数，从而增强机体腹腔巨噬细胞的吞噬功能[42]。另有研究表明，在饲料中添加一定比例的天蚕素可明显提高蛋用仔公鸡的生长性能和免疫器官重量指数，并可以有效降低机体前炎性细胞因子的 mRNA 表达水平，抑制炎症反应，从而增强机体的免疫功能[43]。此外，在饲料中适当地添加 AMPs，不仅可以促进仔猪的生长，增强机体的免疫力，还可以提高饲料的利用率[44]。 5.2 AMPs 在医药研究领域中的应用 目前，AMPs 凭借自身独特的优点已在生物医药研究领域获得初步应用。一方面，AMPs 具有较强的膜活性，可作为运输载体将一些特殊药物递送至细胞内。现已有部分AMPs 开始被用作各种活性分子在细胞内转运的有效载体[45]。另一方面，AMPs 的广谱抗菌活性已开始被作为抗生素的替代药品进行应用性研究。牛明福等[46]采用基因工程方法实现了抗菌肽 CP 在巴斯德毕赤酵母中的重组表达，通过比较其与几种常用抗菌药物联合使用前后的生物学活性，利用分级抑制浓度指数（FIC）探究和分析 AMPs 与不同抗生素间的抗菌作用关系；研究结果表明，抗菌肽 CP 与链霉素、卡那霉素、四环素及多粘菌素 B 联用后展现出不同程度的协同或相加作用；但抗菌肽 CP 与具体各类抗生素之间的相互作用受所试细菌种类和特性的差异性影响又有所不同。这表明该 AMPs 与某些抗生素间存在一定程度的协同或叠加作用，可在某种程度上有效减少或替代抗生素的使用。 6 结语 AMPs 凭借其抗菌谱广、作用迅速、热稳定性好、不易产生耐药性等优点，已逐步发展成为生物医学、兽医学和环境科学等相关方面的研究热点。但 AMPs 在某些方面仍存在一些相应问题：①目前国内外对 AMPs 的作用机制研究主要在人工制作的脂质膜上进行，得出的结论也不尽相同，难以获得一致的解释；②AMPs 虽然在生物体中广泛存在，但因其为免疫系统受到刺激后产生的物质，组织含量极低，且缺少较为成熟、高效的提取纯化方法，加之化学合成成本较高等原因，制约着 AMPs 的广泛应用；③研究表明，AMPs 在某种情况下作为治疗药物长期使用，可能会给机体的天然免疫系统带来一定的威胁，不能完全排除使细菌产生一定耐药性的可能；④为获得更稳定的 AMPs，国内外很多学者利用基因工程技术和计算机辅助技术对其编码序列进行优化或进行结构改造，但所得到的改良型 AMPs 的生物安全性并没有准确的定论，以及基因重组表达载体的构建、表达和纯化等方面，还需要进一步的研究。因此，尽管人们目前已在 AMPs 方面取得了很多的应用性研究成果，但针对 AMPs 的抗菌作用机制、安全性以及耐药性等方面的研究仍需要相关专家和学者不懈地努力探索。 |
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