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条带依旧问题百出？IP/CoIP细节TIPS，为您整理！ 已有1人参与
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细胞功能，最后的执行者大多数都是蛋白质。蛋白质可谓是细胞的调控者，控制着细胞中的所有工作，但是想要细胞高效运作，往往需要多个蛋白参与，蛋白质之间的相互作用，贯穿整个生命周期，参与完整的生命过程。 想要研究清楚细胞的运作机制，蛋白之间的互作就是最基础的研究项目，而 IP/CoIP 则是研究这基础上的常用方法，关于 CoIP 的实验原理和方法前文已科普。 然而IP/CoIP 虽然常用，但并不简单，可以称得上是门技术活，跟着步骤一步步做，都可能会做不出好看的条带图，那其中有哪些需要注意的地方呢 简述实验步骤 Co-IP实验基本步骤 ·温和条件下破碎细胞 ·加入目标蛋白抗体，孵育结合 ·加入亲和介质进行洗脱 ·对洗脱蛋白质进行检测分析 实验中常见的细节TIPS 稍不注意，目的蛋白丢失 1. 非特异的蛋白结合：在免疫沉淀前用 ProteinA/G 珠子预洗，免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或者去垢剂）； 2. 裂解液严谨度太低：改用高严谨度裂解液； 3. 实验仪器或者液体被污染：使用洁净的仪器或者液体； 4. 转移膜上存在非特异性吸附：戴手套、用镊子，不触碰膜转移面。 选择两个不同种源的抗体 在实验中，IP的抗体用量较大，会导致抗体重链55kd的信号会很强。如果用单一种源的抗体作为二抗进行显色，那么抗体重链55kd处的IP抗体的重链会干扰我们对目的蛋白的分辨如果选择两种种源的抗体，则不会有这个问题。 磁珠or琼脂糖？ 任选，种类不重要，关键是品质！ 磁珠或者琼脂糖的作用在于ProteinA/G可以特异性结合免疫球蛋白的FC片段，从而结合抗体，而抗体又可以和目的蛋白结合，优质的磁珠或者琼脂糖珠子对我们实验的成功帮助很大。 CoIP 为何经常遇到假阳性？ 假阳性主要和抗体的浓度还有特异性有关，所以当抗体浓度高了，就降低浓度；抗体特异性差，就更换抗体。 如何去除重链和轻链的影响 阴性对照记得加，可以采用的方法很多，比如用兔的lgG做对照，或者用抗 Fab和Fc的抗体特异性封闭轻链和重链。 蛋白互作信号弱，低到总是测不到 1. 裂解液过于强烈：采用温和的裂解条件，避免破坏细胞内存在的蛋白间相互作用，裂解、洗涤时需使用非变性裂解液，如 NP-40 和 Triton X-100； 2. 受蛋白亚细胞定位的影响：应该重新选择其他裂解液来释放出蛋白； 3. 蛋白间相互作用弱：增加目的蛋白的量，以捕获更多的相互作用蛋白，从而得到更容易观察的结果。具体办法有选择亲和力更强的抗体捕获更多目的蛋白。或者过表达提高目的蛋白的含量。 |
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你好，请问一变性裂解液提取蛋白可以检测到信号，但是用非变性裂解液（NP40， RIPA弱，WB&IP裂解液我都试过）提取蛋白检测不到信号是为什么呢？ 发自小木虫Android客户端 |
2楼2023-09-30 23:50:36
