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荧光原位杂交技术操作的注意事项及常见问题
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什么是荧光原位杂交技术？ 荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。 荧光原位杂交技术的背景及优势 荧光原位杂交技术问世于70年代后期，其曾多用于染色体异常的研究，近年来随着FISH所应用的探针钟类的不断增多，特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现，使FISH技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤学研究，如基因诊断基因定位等 。 原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验均需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较长的曝光时间和对环境的污染等。 此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。与之比FISH则具有： ①操作操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年； ②方法敏感，能迅速得到结果； ③在同一标本上，可同时检测几种不同探针； ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究，而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究等特点。 荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。 将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 虽然FISH具有诸多优点，但是该技术操作相对复杂，以下总结了该项操作的注意事项及常见问题。 1、开展FISH所需要的实验条件和人员培训建立 FISH技术平台，除需要一间可以进行荧光实验操作和显微观察暗室外，还需要原位杂交仪、荧光显微镜、显微镜滤光片、水浴箱、漩涡混合器、普通离心机、移液器、FISH探针试剂盒、无水乙醇、二甲苯、去离子水、橡胶水泥、透明指甲油等设备和试剂。 由于FISH检测具有敏感性和客观性，任何一个步骤的微小失误均有可能对结果的判读产生偏差，进而对临床的合理用药产生影响，因此就对操作的技术人员在熟练和规范程度做出更高的要求。 建议每一个开展分子病理检测的病理科设置专门的分子病理室并由专人操作，并且要求专门的技术人员有相关的分子生物学理论知识，并经过专门培训，有一定的实验室工作经验。 2、固定液的选择及固定时间 石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林固定6～48h，其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。 组织离体后应尽快固定，建议在标本离体后30min内固定。如样本固定不及时，荧光信号会减弱。 固定液的体积是组织体积的4～20倍，否则固定不充分，容易出现无信号或者信号很弱的现象。 而且，为了保证信号的准确性，蜡块最好在2年内进行检测，已经切好的切片在6周内检测最佳。 3、组织切片和载玻片的选择 组织切片4～5μm 厚，过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响，而且切片应完整，质量良好，否则会在预处理时掉片。 载玻片的选择建议使用防脱载玻片，有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片，可有效防止脱片现象的发生。 4、实验过程中切片的预处理 切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时，在煮沸过程中容易掉片，建议烤片温度在56℃过夜。 煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。酶消化是 FISH 实验的关键步骤之一，如果对组织不熟悉，可以先消化推荐的反应时间，然后复染 DAPI在荧光显微镜下观察，在DAPI通道下，以细胞既无空洞(消化过度)，亦无明显的云雾状(消化不足)为最佳，同时可切换观察红绿通道，以红绿通道无明显的背景为佳，如果背景较高，可适当延长消化时间。 另外，对于陈旧的石蜡组织切片，要适当延长消化时间，否则会出现大量的自发荧光。若消化不足所致 FISH 信号减弱或丢失，消化良好时FISH信号较好。 5、变性和杂交 变性和杂交是本实验最关键的步骤，变性的时间和温度是杂交成功是否的关键，为保证变性期间温度的稳定，建议采用专业的原位杂交仪进行变性和杂交步骤，不仅能够减少实验的繁琐性，而且更有利于实验条件的控制，比如时间、温度和避光条件等。为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失和防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。 6、杂交后洗涤温度、时间和封片保存 杂交后的洗涤对于整个实验结果的影响非常重要，首先应保证正确配置杂交洗涤液，洗涤液温度偏高或时间过长，可导致信号减弱，洗涤液温度偏低或者时间过短，会产生杂信号过多、红绿信号对比性差或者特异性低等情况。 在复染完 DAPI 以后，加盖盖玻片，用指甲油固定住盖玻片四角，这样可以防止在油镜下观察时盖玻片脱落。由于荧光信号容易淬灭，所以在染色后应立即观察，如果当时不能观察，可将切片放入切片盒中，保存于－20℃冰箱里2周以内。 7、设置对照 每次实验需设置标准对照: 实验室在每一轮检测中均应使用标准化对照材料( 阳性、阴性和可疑)。如果对照材料没有显示预期的结果，则不能对结果做出判定。 8、结果判读 应选择细胞核大小一致、核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润性癌细胞核中的双色信号。判读标准参考《乳腺癌 HER-2检测指南(2014版)》，对于FISH结果不确定的病例，需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位病理诊断医师重新计数。 如仍为临界值，则应行免疫组化检测(若FISH检测前未行)，也可以选取不同的组织块重新检测。HER-2 FISH 检测在我国发达地区的三级医院已普遍开展，针对HER-2过表达的曲妥珠单抗在我国已上市多年，检测的标准化和结果的正确判读，对于正确选择合适的患者，指导临床治疗显得尤为重要。 国家在大力推广FISH检测方法的同时，还需制定统一的HER-2基因检测的报告指南及早日进行质量化认证，以保证各医院之间的结果相对一致，更好的服务于患者。 |
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