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小RNA是指一类高度保守的长度为18-32nt的RNA分子,主要包括miRNA、siRNA、snoRNA和piRNA等,是生命活动重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。研究表明, 包括癌症、心血管疾病、免疫系统疾病在内的多种疾病与miRNA 的调控作用密切相关。近年来, 由于小RNA测序技术的应用,越来越多的miRNA被发现和功能鉴定,并将广泛应用于疾病诊断、个性化治疗和预后等领域。 技术路线 • Total RNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获得高质量的Total RNA。 • RNA质量检测:Nanodrop检测RNA样品浓度及纯度;琼脂糖凝胶电泳及Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA样品完整性。 • 3’接头连接 • RT引物杂交:RT引物封闭剩余的3’adapter,避免形成接头自连。 • 5’接头连接 • cDNA合成:随机引物反转录合成cDNA第一链。 • PCR扩增  CR富集文库,并引入测序接头序列及index序列。• 文库片段选择:通过PAGE凝胶电泳选择目标文库片段(138-160bp)。 • 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。 • 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。 • 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。 样品要求 • 样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。 • 样品量:细胞样品请提供至少1×106个细胞,组织样品请提供至少100 mg的组织块或切片,RNA样品请提供5 μg以上的总RNA。对于特殊的微量RNA样本,如血清、血浆、免疫共沉淀或外泌体等来源的小RNA总量200 ng以上。 • 样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA,OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。 • 样品保存: 细胞样品:收集细胞至RNase Free 1.5 mL EP管,弃去培养基,用PBS洗一次,弃去PBS,把细胞沉淀保存在-80℃。 组织样品:组织样品离体后放在冻存管中,迅速置于液氮下速冻1分钟以上,然后保存在-80℃。 RNA样品:可将RNA溶于RNase Free 的超纯水中,-80℃保存。 样品保存期间避免反复冻融。 • 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰运输。 测序方案 测序模式 SE50 测序数据量 10M reads 生物信息分析内容 1 miRNA测序分析 2 原始数据质控检查; 3 比对结果质控检查 4 新miRNA预测 5 ncRNA注释(rRNA / tRNA / snRNA / snoRNA /piRNA) 6 基于miRNA表达的样品主成分分析 7 miRNA差异分析 8 差异miRNA靶基因GO功能分析 9 差异miRNA靶基因通路分析 10 差异miRNA与差异表达基因调控分析(如果有mRNA测序结果) 11 差异miRNA与差异表达基因网络绘图(如果有mRNA测序结果) |
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