求助标记了Cy5染料的材料在荧光显微镜下看不到荧光 - 分子生物 - 生物化学

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铁虫 (著名写手)

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求助标记了Cy5染料的材料在荧光显微镜下看不到荧光: 领取红包 (小木虫手机app专属红包)

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题主材料标记了Cy5染料，用荧光分光光度计也能测出发射峰，激发在645nm左右，发射在662nm左右，但用倒置荧光显微镜的Cy5滤光片却看不到荧光，这是为什么？

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1楼2022-10-03 15:43:38

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1420488582

新虫 (初入文坛)

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1. 滤光片不匹配
原因：显微镜的Cy5滤光片组（激发滤光片、二向色镜、发射滤光片）可能未覆盖样品的实际激发/发射波长（645nm/662nm）。例如：

激发滤光片通带过窄或中心波长偏移。

发射滤光片未覆盖662nm附近的信号。

二向色镜的截止波长与Cy5不匹配。

解决方案：

核对滤光片组的规格（激发范围、发射范围、二向色镜截止波长），确保其适用于Cy5（典型激发/发射峰约649/670nm）。

使用分光光度计数据调整显微镜滤光片，或更换更匹配的滤光片组。

2. 仪器灵敏度差异
原因：荧光分光光度计灵敏度远高于显微镜相机（尤其是对低浓度样品）：

分光光度计可能检测到溶液中的高浓度信号。

显微镜观察的样品（如细胞或切片）标记密度低或分布稀疏。

解决方案：

提高样品浓度或标记效率。

延长显微镜相机曝光时间、增加增益或使用高灵敏度相机（如EMCCD/sCMOS）。

3. 光源与光路问题
原因：

显微镜光源（汞灯/LED）老化或强度不足。

物镜数值孔径（NA）低，导致集光效率不足。

光路滤光片或二向色镜污损或装反。

解决方案：

检查光源状态，必要时更换灯泡或调节LED功率。

使用高NA物镜（如NA≥0.7）以提高信号收集效率。

清洁或重新安装滤光片组。

4. 样品制备问题
原因：

样品在固定或封片过程中发生荧光淬灭（如过度交联、使用不兼容介质）。

存在自发荧光干扰（如多聚甲醛固定、未洗净游离染料）。

Cy5在固态或细胞环境中量子效率下降。

解决方案：

使用抗淬灭封片剂（如含DABCO或商业抗淬灭试剂）。

设置阴性对照排除背景荧光，优化洗涤步骤。

验证标记是否成功（如流式细胞术或Western blot）。

5. 光漂白
原因：Cy5易发生光漂白，显微镜观察时因持续照明导致信号快速衰减。

解决方案：

减少曝光时间，使用快速成像模式。

添加抗漂白剂（如Trolox、抗坏血酸）。

6. 检测器设置问题
原因：相机参数（如曝光时间、增益）设置过低，或未覆盖Cy5发射波长范围。

解决方案：

逐步增加曝光时间和增益，观察是否出现信号。

确认相机在近红外区域（660-700nm）的量子效率（可能需要更换相机）。

7. 滤光片组验证
原因：滤光片组可能损坏或标签错误。

解决方案：

使用已知Cy5阳性样品测试显微镜。

用荧光染料标准品（如荧光微球）校准系统。

总结步骤
验证滤光片组：确保激发/发射波长与Cy5匹配。

优化检测参数：调整曝光时间、增益，使用高NA物镜。

检查样品制备：确认标记效率、避免淬灭及背景干扰。

排除仪器故障：测试光源、滤光片和相机性能。

通过系统排查，通常可定位问题并恢复荧光信号的观察。