[交流] 酵母表达系统表达荧光蛋白效果还不错 已有1人参与

2、毕氏酵母PEG1000转化法 (1)试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol 缓冲液B：40%(w/v)PEG1000(sigma)，0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存 注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存; 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行); (2)待转化毕氏酵母的制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d; 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜; 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8; 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次; 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存。 (3)毕氏酵母的转化 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率; 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次; 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀; 30℃水浴孵育1h; 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中; 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中; 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定; 微信图片_20220821094842.jpg

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