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[交流]
毕赤酵母表达系统表达荧光蛋白
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1、毕氏酵母氯化锂转化法 (1)试剂 1M LiCl(用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释) 50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装) 2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用; (2)感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约108 Cells/ml); 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min; 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管; 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中; 按50ul/管分装，立即进行转化; 注：不要将感受态酵母菌冰浴; (3)毕氏酵母的转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA; 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液; 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350 240ul 1M LiCl 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min); 30℃水浴孵育30min; 42℃水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离心收集酵母菌体; 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育; 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定;  微信图片_20220821094842.jpg |
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青椒之路(金币+1): 谢谢参与
青椒之路(金币+1): 谢谢参与
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您好，我们实验室目前也在尝试用毕赤酵母表达带GFP标签的荧光蛋白，也是用的氯化锂转化法，但是很奇怪的是铺板之后完全没办法看到绿色的荧光，然后将长出来的菌落进行了菌落pcr确能够有目标条带，可以问下您对这种情况有了解嘛？ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2022-08-29 22:32:11
不吃鱼.6楼2022-08-31 14:05:46
8楼2022-09-01 09:55:00
9楼2022-09-01 23:08:35
10楼2022-09-04 02:55:38
11楼2023-06-09 15:13:07
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tzynew2楼
2022-08-21 09:55
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2022-08-22 11:30
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假大空4楼
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蒙塔基的钢蛋zh12楼
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