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青椒之路

铜虫 (正式写手)

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[交流] 毕赤酵母表达系统表达荧光蛋白

1、毕氏酵母氯化锂转化法
(1)试剂
1M LiCl(用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释)
50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装)
2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存
注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;

(2)感受态毕氏酵母的制备
接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约108 Cells/ml);
收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min;
重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管;
离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中;
按50ul/管分装，立即进行转化;
注：不要将感受态酵母菌冰浴;

(3)毕氏酵母的转化
煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA;
将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液;
对于每一个转化，按以下顺序加入：
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul
剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);
30℃水浴孵育30min;
42℃水浴热休克20～25min;
6000～8000rpm离心收集酵母菌体;
重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育;
1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定;

微信图片_20220821094842.jpg

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1楼 2022-08-21 09:54:10

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不吃鱼.

新虫 (小有名气)

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★
青椒之路(金币+1): 谢谢参与

您好，我们实验室目前也在尝试用毕赤酵母表达带GFP标签的荧光蛋白，也是用的氯化锂转化法，但是很奇怪的是铺板之后完全没办法看到绿色的荧光，然后将长出来的菌落进行了菌落pcr确能够有目标条带，可以问下您对这种情况有了解嘛？

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5楼2022-08-29 22:32:11

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青椒之路

铜虫 (正式写手)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by 不吃鱼. at 2022-08-29 22:32:11
您好，我们实验室目前也在尝试用毕赤酵母表达带GFP标签的荧光蛋白，也是用的氯化锂转化法，但是很奇怪的是铺板之后完全没办法看到绿色的荧光，然后将长出来的菌落进行了菌落pcr确能够有目标条带，可以问下您对这种情 ...

做过，这是正常的

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