24小时热门版块排行榜

>论坛更新日志 (4350)
>文献求助 (251)
>导师招生 (237)
>博后之家 (225)
>论文投稿 (206)
>虫友互识 (157)
>硕博家园 (81)
>有机交流 (80)
>考博 (69)
>招聘信息布告栏 (44)
>学术会议 (35)
>休闲灌水 (31)
>基金申请 (20)
>找工作 (18)
>考研 (15)
>SciFinder/Reaxys (13)

返回列表

【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者青椒之路的 2 个金币，回帖就立即获得 1 个金币，每人有 1 次机会

青椒之路

铜虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1471.6
帖子: 631
在线: 45.7小时
虫号: 30599487

[交流] 毕赤酵母表达系统表达荧光蛋白

1、毕氏酵母氯化锂转化法
(1)试剂
1M LiCl(用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释)
50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装)
2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存
注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;

(2)感受态毕氏酵母的制备
接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约108 Cells/ml);
收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min;
重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管;
离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中;
按50ul/管分装，立即进行转化;
注：不要将感受态酵母菌冰浴;

(3)毕氏酵母的转化
煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA;
将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液;
对于每一个转化，按以下顺序加入：
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul
剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);
30℃水浴孵育30min;
42℃水浴热休克20～25min;
6000～8000rpm离心收集酵母菌体;
重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育;
1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定;

微信图片_20220821094842.jpg

回复此楼

» 猜你喜欢

现代”学阀”该如何界定已经有11人回复
各位大神，目前国内有哪些比较好用的逆合成软件？已经有15人回复
国社科系统bug了，是不是要放榜了？已经有10人回复
课题组招2027级博士上海工程技术大学激光智能制造方向已经有4人回复
上海工程技术大学激光智能制造课题组 2027级博士研究生招生已经有3人回复
上海工程技术大学激光智能制造课题组｜2027级博士研究生招生公告已经有11人回复
申博发邮件已经有11人回复
我的奶奶已经有3人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2022-08-21 09:54:10

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

不吃鱼.

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 438.2
帖子: 111
在线: 9.2小时
虫号: 26017573

★
青椒之路(金币+1): 谢谢参与

您好，我们实验室目前也在尝试用毕赤酵母表达带GFP标签的荧光蛋白，也是用的氯化锂转化法，但是很奇怪的是铺板之后完全没办法看到绿色的荧光，然后将长出来的菌落进行了菌落pcr确能够有目标条带，可以问下您对这种情况有了解嘛？

发自小木虫Android客户端

赞一下

回复此楼

5楼2022-08-29 22:32:11

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

青椒之路

铜虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1471.6
帖子: 631
在线: 45.7小时
虫号: 30599487

引用回帖:

5楼: Originally posted by 不吃鱼. at 2022-08-29 22:32:11
您好，我们实验室目前也在尝试用毕赤酵母表达带GFP标签的荧光蛋白，也是用的氯化锂转化法，但是很奇怪的是铺板之后完全没办法看到绿色的荧光，然后将长出来的菌落进行了菌落pcr确能够有目标条带，可以问下您对这种情 ...

做过，这是正常的

发自小木虫Android客户端

回复此楼