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外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（二十一）
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今天分享一篇发表在Analytical Chemistry（2022年IF=8.008）上的文章，名为《Noninvasive Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma Based on Phenotypic Profifiling of Viral and Tumor Markers on Plasma Extracellular Vesicles》[1]（基于血浆胞外囊泡上病毒和肿瘤标志物表型分析的鼻咽癌无创诊断）。

鼻咽癌(NPC)是一种在东亚和东南亚地区发病率较高的头颈部癌。由于鼻咽癌位置隐匿，症状不明显，传统组织活检的侵袭性，磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)特异性不足，大多数鼻咽癌病例诊断为晚期，转移风险较高，5年生存率低于40%。慢性鼻咽炎(NPG)作为头颈部良性炎症性疾病，通过传统内镜可误诊为鼻咽癌或健康供体，导致不适当或延迟治疗。因此，鼻咽癌的早期诊断以及鼻咽癌与NPG的鉴别对改善患者预后具有重要的临床意义。

鉴于超过95%的鼻咽癌病例与潜伏的Epstein?Barr病毒(EBV)感染相关，循环中的抗EBV-IgA抗体、EBV DNA和EBV编码的micro RNA(EBV miRNAs)已被开发作为鼻咽癌诊断的无创标记物。然而，抗EBV-IgA也在头颈部慢性疾病和健康个体中非特异性检测到，导致鼻咽癌过度诊断和不必要的组织活检。虽然循环EBV DNA的定量测定具有较高的特异性，但对早期或复发性鼻咽癌的诊断缺乏敏感性。同时，EBV miRNA在鼻咽癌诊断中的临床潜力仍存在争议。因此，寻找新的循环生物组织中准确、无创的液体活检标志物对于鼻咽癌筛查是非常亟需的。

细胞外囊泡(EVs)，即纳米级的膜性囊泡(40?1000nm)，由于其在体液中的丰富存在、生物稳定性和与肿瘤生物学的密切关系，在液体活检中显示出了诱人的潜力。在EV中所包含的所有生物分子中，EV膜蛋白被广泛探索作为疾病诊断和预后的标志物。具体来说，EBV编码的LMP1蛋白、肿瘤蛋白CD109和EGFR，通过先进的信号扩增方法，都在鼻咽癌患者血浆EV上被发现 。然而，这些集成平均方法需要复杂的预处理过程，并且往往会掩盖宿主细胞来源的海量EV中高度特异性但罕见的EV亚型的信息。此外，EV标记物在鼻咽癌、NPG和健康供体鉴别诊断中的临床潜力研究也很少。LMP2A是另一种常被研究的EBV编码蛋白，在鼻咽癌发病机制中发挥重要作用，并与鼻咽癌的不良预后相关。此外，它是在鼻咽癌组织中特异性检测到的，而不是其他与EBV相关的疾病。尽管有这些发现，LMP2A作为EV标记物的临床价值仍有待探索。

用于EV蛋白质分析，与其他传感器平台相比，纳米流式检测技术(nFCM)有一个很大的优势在快速而灵敏的分析单一EV小到40nm且拷贝数非常低的特定表面蛋白，确保了在复杂的生物流体样本中检测特定的EV亚群粒子浓度的准确性。在这里，我们开始探索病毒(LMP1和LMP2A)和肿瘤(PD-L1、EGFR、EpCAM)标记物在鼻咽癌和NPG诊断中的临床应用。通过nFCM的单颗粒计数方法，对每个受试者的无血小板血浆(PFP)中5种EV亚型的浓度进行定量。未加权的SUM signatures在鉴别鼻咽癌患者与健康供体和NPG患者方面具有很大的准确性。值得注意的是，我们发现LMP1和LMP2A联合，这两种病毒编码蛋白通常与鼻咽癌发病机制相关，是对NPG患者诊断的重要标志。该方法在临床上在提高鼻咽癌和NPG的常规诊断方面具有巨大的潜力。

研究结果：

一、EBV编码的LMP1和LMP2A在鼻咽癌细胞和EV中表达

EBV编码的潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A已在EBV感染的细胞中被鉴定出来。我们首先通过流式细胞术研究了它们在鼻咽癌细胞系C666-1上的表达，该细胞系始终携带EBV(图1a?c)。以人鼻咽上皮细胞系NP69为阴性对照。与预期的一样，C666-1同时表达LMP1和LMP2A，WB证实了这一观察结果(图1d)。同时，流式细胞术和WB分析均显示LMP2A的表达相对高于LMP1。

然后，通过nFCM检测从条件细胞培养基(CCCM)中纯化的EV上LMP1和LMP2A的表达水平(图1e，f)。藻红蛋白(PE)荧光与侧散射(SSC)的双变量点图显示，来自C666-1细胞的EV中LMP1和LMP2A阳性EV的百分比分别为9.2和6.8%(图1e)。同时，来自NP69细胞的EV中LMP1和LMP2阳性EV的比例为1.9%，与IgG1同型对照（1.5%）相当(图1f和S1j)。为了符合EV研究的最低信息制定的指南(MISEV2018)，国际细胞外囊泡协会的立场声明，通过透射电镜(TEM)评估了EV的形态。另一方面，如前所述，通过nFCM对大小分布和一些检测对照进行了分析。然而，由于WB灵敏度不足，C666-1 EV中LMP1和LMP2A的存在无法通过蛋白印迹检测到（数据未显示）。

二、LMP1和LMP2A是EBV阳性鼻咽癌细胞来源EV的特异性指标

为了进一步验证EBV阳性鼻咽癌细胞来源EV特异性表达LMP1和LMP2A蛋白，我们鉴定了从EBV阴性鼻咽癌细胞系CNE1和其他四个常用的癌症细胞系(人类三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231，人肝癌细胞系HepG2，人类结直肠癌细胞系HCT15和人类宫颈癌细胞系HeLa)的CCCM分离的EV。除LMP1和LMP2A外，我们还对3种常用的肿瘤蛋白标记物(PD-L1、EGFR、和EpCAM)和3种典型的EV标记物(CD9、CD63和CD81)的表达水平也进行了分析。图S2a显示了PE荧光与SSC的代表性双变量点图，热图(图2a)总结了6种不同癌细胞系中每种表达8种不同蛋白标记物的EV亚群的平均百分比。显然，EV表面蛋白的图谱在不同来源细胞之间是高度异质性的。虽然C666-1中LMP1和LMP2A阳性EV的百分比不是很高，但它们的表达与含有EBV的鼻咽癌细胞特异性相关。LMP1和LMP2A的C666-1 EV与来自其他细胞系的EV之间的子集百分比的统计学意义(P值)见图2b，其他6种蛋白的统计学意义见图S2b。LMP1和LMP2A在从其他EV中区分C666-1 EV时均优于其他蛋白标记，所有P值均低于所有其他蛋白标记(图2b，c)。这些结果表明，血液中LMP1和LMP2A阳性的EV可能在鉴别EBV相关的鼻咽癌与其他癌症方面具有很大的临床潜力。

三、建立一个训练队列中鼻咽癌诊断的五标志物集

考虑到传统的EV标记物CD9、CD63和CD81并不在肿瘤EV上特异性表达，我们只将5个癌症相关标记物(LMP1、LMP2A、PD-L1、EGFR和EpCAM)纳入我们的标记物面板进行临床检查。42例新诊断的鼻咽癌患者(II期?IV期)和40例健康供者的PFP样本被纳入培训队列(表S1)。据报道，脂蛋白等非囊泡性污染物可能不可避免地与血浆EV共分离。此外，PFP EV样本中表达表面蛋白的百分比很容易受到脂蛋白水平的影响。另一方面，用0.1%TritonX-100对抗体染色的EV样本处理5 min后，LMP1和LMP2A阳性实体几乎完全消失(图S3a，b)，这证实了它们作为膜结构EV。因此，我们利用表达表面蛋白的EV亚群的浓度，而不是其百分比，作为区分鼻咽癌患者和健康供体的指标。与健康供体相比，通过nFCM单粒子计数测定的鼻咽癌患者中所有五种蛋白标记物的EV亚群浓度均显著高于健康供体(P< 0.0001)（图3a）。图3b绘制了5个EV子集浓度的未加权和。采用ROC分析来评估单个EV标记物和EV SUM5的诊断能力(图3c)。曲线下面积(AUC)的统计值显示在表1中的训练队列面板中。当单独使用时，LMP2A和LMP1在区分鼻咽癌患者和健康供体时的AUC值分别为0.98和0.93(图3c)，与LMP1阳性EV相比，LMP2A阳性EV对鼻咽癌诊断表现出更高的敏感性、特异性和准确性（表1，训练队列组）。同时，EV SUM5在鼻咽癌诊断中表现最好，AUC值为1.0，敏感性为100%，特异性为100%，准确率为100%(图3c和表1)。此外，早期(II)(n=15)和晚期(III?IV)(n=27)阶段的鼻咽癌患者可以通过EV SUM5值与健康供体区分开来(图S3c和表S2)，提示其在早期鼻咽癌诊断方面的临床潜力。此外，我们还推测，在癌症患者中有更多的循环EV，以赋予增强的细胞间通信和疾病发病机制。虽然鼻咽癌患者与健康供体之间总EV的一致性存在显著差异(P< 0.0001，图S3d)，42例鼻咽癌患者中只有27例被正确诊断，敏感性为64.3%（表1）。

在临床环境中，抗EBV衣壳抗原(VCA-IgA)的IgA抗体滴度通常通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来测定，并被认为是鼻咽癌诊断的一般标志物。作为比较，我们测量了所有82份临床PFP样本的VCA-IgA滴度。虽然鼻咽癌患者的PFP中的VCA-IgA水平明显高于健康供体(P< 0.0001，图S3e)，两组之间有相当大的重叠，只有66.7%的鼻咽癌患者（42例中的28例）被诊断为VCA-IgA阳性患者(>1.1U/mL，临床实践中使用的阈值)（表1）。与总EV浓度和VCA-IgA滴度相比，EV SUM5对鼻咽癌的诊断具有最好的鉴别能力(图3d)。根据对5个亚群EV浓度的t-SNE分析，可以将82个临床样本分为两个不同的亚群，分别为鼻咽癌患者和健康供体(图3e)。

四、鼻咽癌诊断的检测队列

另一个由14名鼻咽癌患者(6名II期患者和8名III期患者)和14名健康供体(HD)组成的独立队列，以双盲方式验证提出的鼻咽癌诊断策略(表S1)。使用训练队列的相同标记集进行nFCM表征。雷达图显示，5种EV蛋白标记物的组合可以完全区分鼻咽癌患者和健康供体(图4a)。根据训练队列的Youden指数计算的截止值，测试队列的EV SUM5的敏感性、特异性和准确性见表1（测试队列面板）。与训练队列的结果一致，EV SUM5在区分鼻咽癌患者和健康供体方面仍然优于所有单一标记物、总EV浓度和VCA-IgA滴度(P< 0.0001) (图4b和S3f?h和表1)。使用EV SUM5的截断值，一名健康供体和一名鼻咽癌患者最初被预测为与常规组织活检的诊断结果相反的状态(图4b)。然而，重新检查临床信息后，我们发现异常值(EV SUM5=3.4×10^7颗粒/ml，低于截止值4.4×10^7颗粒/ml)组织活检预测鼻癌组实际上是一个肝癌患者颈部肿瘤和误诊为“鼻咽癌的肉芽肿病变，”不应该被认为为鼻咽癌患者。因此，对于检测队列，EV SUM5不仅在区分NPC(II?IV)患者和健康供体方面，比任何单一标记物或VCA-IgA抗体滴度（表1，检测队列面板具有最佳的表现（准确性=96.3%）；图4c），而且与CD109和EGFR标记物联合提供的敏感性为84.1%和85.0%的特异性相比，还显示出更高的敏感性（92.9%）和特异性（100%）。更详细地说，EV SUM5在鉴别早期(II)鼻咽癌与健康供体方面的准确率为95.7%，显示了其在鼻咽癌早期诊断中的临床应用价值(表S3)。综上所述，我们的结果表明EV SUM5是优异的NPC分类器。

五、鼻咽癌患者、NPG患者和健康供者鉴别的EV SUM5特征

慢性鼻咽炎(NPG)是头颈部发生的良性炎症性疾病之一。然而，它也会严重损害患者的生活质量。NPG患者与鼻咽癌患者的区分可以降低鼻咽癌的过度诊断率，避免了NPG患者的高治疗负担、心理压力和增加的成本。另一方面，一些NPG患者存在发展为恶性鼻咽癌的风险，他们的诊断可以为发展为恶性鼻咽癌肿瘤之前提供治疗机会。

为了进一步扩大EVSUM5的临床应用价值，我们分析了另一组患者队列：鼻咽炎患者(NPG，n=23)，包括慢性鼻咽炎、慢性鼻窦炎和鼻前庭炎患者(表S4)。将NPG的EV谱与训练队列中的鼻咽癌患者（n=42）或健康供者(HD，n=40)进行比较。热图(图5a)总结了单个标记物和SUM signatures的EV子集浓度。如图S4a所示，NPG的EV SUM5值高于HD，但明显低于鼻咽癌患者。在鼻咽癌患者与NPG患者的区分方面，EV SUM5优于其他5个单一标志物，AUC为0.80，敏感性为100%，特异性为52.2%，准确率为83.1%(表2和图5b)。同时，使用EV SUM5区分NPG患者与健康供体的准确率为80.9%。我们推测，癌症标志物(PD-L1、EGFR和EpCAM)的参与可能会影响NPG和健康供体之间分化的鉴别能力。用EV SUM2替代EV SUM5和LMP1和LMP2阳性EV后，观察到NPG患者与健康供体的AUC值（0.79）、敏感性（69.6%）、特异性（90.0%）、90.0%)和准确性（82.6%）的改善(表2和图5c和S4b，c)。相比之下，VCA-IgA滴度对鉴别鼻咽癌患者和NPG患者的准确性以及NPG患者与健康供体的鉴别率分别仅为73.8%和76.2%(表2和图S4e)。这些结果强调了EV SUM5在鼻咽癌患者与NPG患者鉴别和EV SUM2在NPG患者与健康供体鉴别方面的临床潜力。


总结：

综上所述，最近开发的nFCM技术能够对小至40nm的单个EV进行灵敏和稳健的分析，已被应用于分析小至40nm的单个EV上拷贝数非常低的表面蛋白。通过nFCM在单囊泡水平对血浆EV进行表型分析，首次研究了两种EBV编码蛋白(LMP1和LMP2A)在鼻咽癌和NPG患者鉴别诊断中的临床应用。在结合其他三种肿瘤标志物(PDL1、EGFR和EpCAM)后，我们发现EV SUM5和EV SUM2在鼻咽癌和NPG患者的诊断中分别优于传统的VCA-IgA检测，具有较高的预测值。我们设想提出的策略和标记集可以应用于鼻咽癌和NPG的临床实践。

在本研究中，考虑到EV的体积小和多种抗体的空间位阻，我们在不同的试管中标记EV样本，以获得每个EV亚群的真实信号。在未来，我们将使用有机染料标记抗体而不是藻红蛋白偶联抗体和纳米体或适配体代替抗体来探索对单个EV进行多重标记的可行性。个体EV的多种蛋白表达可在癌症检测中获得进一步的诊断效力。

文章就分享到这里，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Hu Yunyun,Tian Ye,Di Haonan,et al.Noninvasive Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma Based on Phenotypic Profiling of Viral and Tumor Markers on Plasma Extracellular Vesicles.ANALYTICAL CHEMISTRY.2022;94 (27)：9740-9749.doi:10.1021/acs.analchem.2c01311

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