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ZMQ68

新虫 (初入文坛)

[交流] EMSA!!! 已有5人参与

最近做EMSA,EB染色后DNA片段一直看不到。想请教有经验的前辈一些问题!!!!!

启动子必须加探针标记吗???很无知无助无力了。。我现在只用了纯化后的启动子片段跟蛋白孵育后跑Native-PAGE,用考马斯染蛋白有正确条带,很正常。
但是用EB染色20min紫外照胶却看不到DNA条带,不知道什么原因。是不是DNA浓度低,有没有做相关的实验,能否告知一下您的实验条件参考一下,,不胜感激!!!!!

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armigera

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: originally posted by zmq68 at 2022-08-05 16:14:50
请问你dna探针不标记尝试过吗?如果浓度足够高,不标记是否可行?期待回帖!
...

根据我曾经的经验,自由探针(未结合蛋白)是大多数, 结合的只是少数。所以你能看到总的dna并不能代表能看到结合的条带。以上是我的推测,欢迎一起讨论。
我之前用同位素标记的,没有做过未标记直接染色的。

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9楼2022-08-05 21:38:35
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pennchem

专家顾问 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
(1) 探针的浓度够吗? (单独跑探针染色能染上吗)
(2) 探针的大小(是否太大,没有进入分离胶;是否太小,已经跑出去了?)
(3) 探针与蛋白结合的条件是否有利于结合(镁离子是否必须,盐离子浓度超过100mM了吗? 缓冲液的pH值是多少?)
(4) 在(3)的条件下,探针是否与蛋白结合(有实验证据吗)
(5) 是否有可能存在探针被降解的可能?
(6) 电泳过程是否大量产热,是否导致蛋白变性,或者复合物解离?
(7) 一步步做对照试验吧,一个实验不成功,很难说明哪(几)个步骤有问题

good luck~
行至水穷处,坐看云起时
2楼2022-08-04 17:43:41
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jinvijie

铁虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我也好奇启动子不标记是否可以检测出来

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找博导:硕士肿瘤药理学-分子生物学方向,六级已过,口语达到能表达自己,SCI二区。
3楼2022-08-05 00:24:08
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xuxinH

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
要加标记的探针吧

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4楼2022-08-05 00:57:56
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