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吉田bio铜虫 (小有名气)
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免疫功能低下症动物模型
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免疫功能低下症动物模型 【造模机制】环磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)是强的免疫抑制剂，对多种免疫活性都有抑制作用，作为抗癌药和免疫抑制剂在临床广泛使用，但在杀伤癌细胞的同时也明显损伤快速增殖的正常细胞，特别对免疫系统和造血功能产生严重损害,对体液免疫和细胞免疫均有作用。环磷酰胺主要破坏 DNA的结构与功能，进而抑制 DNA的复制和蛋白质的合成，抑制细胞分裂，致使免疫功能低下。 【造模方法】选用 ICR小鼠,（18±2）g,雌雄兼用。仪器药品：分光光度计、荧光显微镜、环磷酰胺、绵羊红细胞(SRBC)、RPMI-1640培养液等。将 20只小鼠，按性别及体重随机分成2组，每组10只,雌雄各半。正常对照组：生理盐水 50mg/kg 行腹腔注射；模型组：Cy 50mg/kg 行腹腔注射。每日一次,连续2天。造模不同时间进行下列指标检测： 1.血清中1gM的测定 给药第1天每只鼠腹腔注射10% SRBCO.2ml 致敏，致敏后第5天，摘除眼球取血，把收集的血清作 800倍稀释后，吸取 0.5ml 稀释的血清放入另一试管中，依次加入10% SRBC、补体、生理盐水各0.5ml，对照组用生理盐水代替血清，混匀，置37℃温箱温育1小时，离心（3000r/min)5分钟,取上清液用分光光度计（波长 540nm)测OD值。 2.NK细胞活性测定 采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）：①效应细胞制备：给药5天后，断头取血，常规无菌制备单个脾细胞悬液，用含 50ml/L小牛血清的Hank's液洗2次,1000r/min 离心10分钟、于第2次离心后,弃去上清液，用含100ml/L牛血清的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为2×10°个/ml:②粑细胞制备：实验前 24小时将靶细胞YAC1进行传代培养,用前以 hank's液洗3次,用含 100ml/1.牛血清的 PR-MI-1640完全培养液重悬（活细胞数>95%），调整细胞浓度为1×105个/ml，使效靶比为20：1。取靶细胞和效应细胞各100μ1加入96孔板中，每个样品做3个复孔，同时设不加靶细胞的效应细胞对照孔和不加效应细胞的靶细胞对照孔各3个复孔。每孔加入 MTT （5mg/ml)溶液10μl，置37℃、5%的CO培养箱中培养4小时，1500r/min 离心15分钟，弃上清。每孔内加入150μ1二甲基亚硕（DMSO），置振荡仪上振荡5分钟，使 MTT还原产物甲聩（formazan）完全溶解，测定570nm处光吸收度（A值），结果以 NK活性表示，其计算方法为：NK活性（%）=1-（实验孔A均值-效应细胞孔A均值）÷靶细胞孔 A均值×100%。 3.血清溶血素测定 采用免疫溶血法。于给药第1天，每只小鼠腹腔注射0.2ml SR-BC致敏，致敏后第5天处死，用冷的Gey液制成脾细胞悬液(5×10°/L)，然后取试管若干支，每管依次加入牌细胞悬液、0.2% SRBC、1：10豚鼠血清各 0.5ml,另设不加补体的空白对照。置 37℃水浴1小时，离心（3000r/min)5分钟，取上清液。用分光光度计（波长413nm）测吸光度。 4.白介素 2(1L.-2）测定 经眼眶取血,离心(3000r/min)20分钟取血清。采用放射免疫方法测定各组小鼠血清IL-2含量。 5.T淋巴细胞亚群(CD4、CD8）测定 采用单克隆抗体(MCAB)间接免疫荧光法制作鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度至1×10/ml，每1×106细胞加入 100μ1 荧光抗体和1:5 稀释 FIT 标记抗鼠 IgG 抗体 100μl。4℃反应30分钟后在荧光显微镜下计算荧光阳性细胞百分率。 【模型特点】Cy组小鼠血清中IgM水平明显降低，NK细胞活性下降。溶血素值下降，血清中IL-2含量明显减少，Cy模型组CD4+、CD8+细胞数及 CD4+/CD8+细胞比值均明显低于正常对照组。 【注意事项】 1.Cy对肿瘤细胞和正常细胞的选择性不高 超量或长期使用会明显降低机体的免疫力。鉴此用于中药对于提高免疫功能低下症的研究时一般预先给动物服药。 2.利用Cy复制免疫功能低下症的动物模型有多种方式如：大剂量一次给予的复制方式（100mg/kg或200mg/kg）、小剂量多次给予的复制方式（50mg/kg，每日一次，连续 2天；或40mg/kg，每日一次，连续3天）。应根据具体情况选用合适的造模方法 【应用范围】该模型可用于中药对于提高免疫功能低下症的研究，亦可用于具有免疫调节作用的保健食品或药品的功效研究。 |
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