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金色海豚金虫 (小有名气)
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[求助]
乳杆菌的电转化------跪求大神指导！！！
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乳杆菌电转化-----跪求大神指导！！！ 将重组质粒电转到植物乳杆菌以后，培养了4-5天，平板上只长了一个菌落（但感受态在抗性平板上隔了一天才长的，长得很多），我P了但没有P出来条带，是没转进去吗？（电转时间是2ms左右，质粒是2ul+50ul感受态）。感受态是野生菌株，是自己制备的。质粒浓度是200ng/ul。我听说3-5ms说明转化效率比较好，我这个是不是时间太短了啊，或者会是感受态制备有问题吗？拜托大家帮忙分析下原因吧  乳杆菌感受态制备流程如下： 将冻存的植物乳杆菌划MRS平板复苏，挑取单个菌落在MRS液体培养辈中30℃培养过夜，以1：100的比例接入50 mL新的MRS液体培养基30℃培养，监测0D500至0.3-0.4，迅速置冰上冷却，4℃ 6000×g离心20 min，弃上清；用50 mL预冷的0.5M庶糖、10%甘油溶液重悬菌体，4℃ 6000×g离心20min，弃上清；用25mL预冷的0.5M庶糖、10%甘油、50mM EDTA溶液重悬菌体，4℃ 6000×g离心15min，弃上清；再用15 mL预冷的0.5M庶糖、10%甘油溶液重悬菌体，4℃ 6000X g离心15 min，弃上清；最后用500 µL预冷的0.5M庶糖、10%甘油溶液重悬菌体，即为植物乳杆菌感受态细胞，50µL每管分装，-80℃保存备用。 电转过程如下： 取2ul重组质粒加入50ul上述制备好的植物乳杆菌感受态，轻轻混匀；将以上混合物转入冰预冷的2mm电激杯，迅速给予一个单脉冲，参数设置为2kV，25 F，200Q, 电击后立即轻柔加入1mL冰预冷的恢复培养基MRS培养基，将菌液全部吸入一灭菌离心管，盖紧管盖，冰浴5min 后30℃静置培养2h；将l00µL菌液涂布于含有5ug/ml的红霉素MRS平板上，37℃静置培养1-2天。 |
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