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动物建模 | 关于动脉粥样硬化的建模方法研究
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动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)作为一种慢性炎症性疾病，是由多种因素共同作用引起的，发病机制复杂。构建AS动物模型对于探究AS的病因、发病机制、防治和药物研发具有重要意义。目前有关AS的发病机制的假说有：脂质浸润学说、钙超载学说、内膜损伤学说、免疫反应学说等。虽然这些假说都从某一方面解释了AS的发病机制，但这些假说并不能全面的阐述AS的发生、发展过程与机理。在AS的发展过程中，大量脂质在血管中积累，钙质也在血管沉积从而导致血管钙化、血管内皮损伤，此变化加剧了脂质的侵入和损伤，同时又有炎性因子引起的免疫反应，多种因素共同作用导致AS。因此，为了深入探究AS的发病机制，构建一个合适的AS动物模型是非常重要的。 实验动物选择 AS常用于研究该疾病的实验动物有：猪、猴、家兔、鹌鹑、大鼠和小鼠等。鼠类因其体型小、生存能力强、繁殖迅速、获取容易等优势一直被作为临床试验中应用范围最广、应用数量最多的实验动物，尤其是ApoE基因敲除等转基因小鼠被广泛用于复制AS模型。其优点为能自发形成AS，普食喂养便可形成严重的高脂血症，高脂饮食喂养可加速斑块的形成，且其斑块的分布与人类AS的分布极为相似，但由于体型小、可获得的血液样本少等缺点无法进行类似多指标血液检测等的实验研究。由于大鼠具有应用范围广泛、体型较大、获取容易、饲养方便、死亡率低、能够获取足够的血液及其组织标本等特点，越来越多研究学者更倾向于用大鼠来建立AS模型. 方法盘点 单纯高脂饲料建立AS模型 大部分AS模型的建立都是基于大量的脂质再结合其他方法共同构建模型，血浆胆固醇水平与AS的产生呈正相关。因此，建模时的高脂饲料配方多以高比例的胆固醇、猪油等作为脂质来源。高脂饲料配方多由1%~3%胆固醇、8%~10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5%白糖、81.3%~85.3%普通饲料组成。纯高脂饲料喂养法构建AS模型的方法优点是操作相对简单。成本也比较低廉，但缺点就是动物成模率较低，且造模周期也较长，无法形成稳定的AS斑块。因此大多数实验研究更倾向于在高脂饲料喂养的基础上联合应用其他损伤操作，达到构建模型更好更快的目的。 高脂饲料联合维生素D建立AS模型 有研究者采用含1％胆固醇高脂饲料联合维生素D3(700 000 U／kg) 的制备方法于饲养6周后成功建立稳定、可重复的AS模型。另有研究者以高脂饲料为诱导联合腹腔注射维生素D3注射液，6周后成功复制AS大鼠模型。AS模型大鼠的主动脉内皮细胞增殖，泡沫细胞堆积，主动脉内膜介质明显厚于正常组的主动脉内膜，与正常组大鼠的AS病变比较，AS模型组病变明显增加。 使用维生素D配合制备AS模型的方法有多种。常用腹腔注射法、灌胃或直接大剂量添加到饲料中，可根据不同的实验需求和目的自行选择。高脂饲料喂养结合维生素D3，复制模型的实验方法优点是实验操作比较简单，大鼠的整个AS发生发展过程比较稳定．这种方法比较好地弥补了AS病变过程中里只有胆固醇沉积而缺少钙沉积的缺点，是一种比较有效且常见的AS模型复制方法。 但是，采用此方法制备AS模型时对于维生素D的给药剂量及给药周期要求比较严格，给药剂量太高或者过低都不利于模型的成功复制。剂量过高会导致大鼠厌食严重、体型消瘦、体重减轻甚至死亡，过低又不易形成AS典型病理状态，因此。在造模过程中应密切观察动物的精神状态、饮食情况和体重变化，结合自身的实验需求进行复制模型。但此造模方式耗时较长，要保持足够的耐心。 高脂饲料联合免疫炎症建立AS模型 有研究者利用大鼠腹腔注射维生素D3和卵清白蛋白致敏，造成大鼠免疫炎症，高脂饲料喂养14周后大鼠主动脉出现AS斑块。但此方法尚在起步阶段，许多方面不成熟，且此方法难免会对动物产生免疫损伤等不良反应。原理基于ROSS于1999年提出AS是一种炎症性疾病，炎性细胞通过吞噬作用清除脂质物质，同时形成泡沫细胞，并形成脂质沉积核心，引起AS斑块的形成。 机械损伤法建立AS模型 1.球囊损伤术 球囊损伤术是制备血管损伤后再狭窄模型的常见方法，此方法的主要操作是将一定直径大小的球囊放入动脉血管后充盈球囊，通过反复拖拉充盈后的球囊造成动脉血管内皮细胞损伤，造成内皮细胞的即刻脱落，弹力板及中膜严重损伤。引起局部血管狭窄。有研究者将高脂饲料喂养、维生素D，腹腔注射和球囊损伤术联合应用建立大鼠AS模型，给予大鼠1次性腹腔注射维生素D400 000 U／Kg，高脂喂养7d后进行球囊手术，6周后造模成功。 进行球囊损伤手术时需要注意选择内径大小适宜的球囊，牵拉过程中速度、力度的把握以及对球囊扩张压力的控制。球囊扩张太过、来回牵拉太快或操作人员用力过大都会容易造成动脉的破裂，过度损伤；反之扩张不够、牵拉过于缓慢又不能造成有效的内膜损伤，所以建立成功的AS模型，球囊损伤术对操作人员技术要求比较高。在球囊损伤手术之后的3～5 d需密切观察动物状态，还需腹腔注射青霉素钠防止术后感染，造成不必要的死亡与损伤。 2.电击损伤术 此方法原理为通过一定的电击刺激可引起血管内膜损伤，激活血小板，血小板聚集后会释放出一些活性物质，这些物质则会促进内皮细胞损伤，使其损伤加重，随着时间的延长，可形成明显的AS斑块。有研究者利用高脂饲料及颈动脉电击损伤联合作用制备AS模型．通过对影响因素的多次实验筛查，最终大鼠高脂饮食联合腹腔注射维生素D，加颈动脉电击损伤(1 mA、5 min)复合因素所致的AS模型建立成功。 此手术方法对于电流强度与电击时间要求比较严格，电流强度过大时容易造成动脉血管壁出现比较明显的焦灼痕且容易导致动脉穿孔。电击造成的损伤严重破坏动脉血管壁结构，导致大鼠死亡率增高．这也是大多数研究者不常采用此方法的原因之一。 3.动脉钳夹术 手术动脉钳夹法的原理是机械压迫阻断动脉正常供血，导致局部血管缺血缺氧，颈动脉内膜损伤，引发炎性反应，进而促进AS的发生。有研究者使用血管钳夹住大鼠一侧颈动脉20 min，手术后以高脂饮食喂养，6周时大鼠动脉内膜便有明显增厚，大量泡沫细胞聚集的现象，10周时形成典型纤维帽．成功建立大鼠AS模型。此方法建立AS大鼠模型的优点在于能够人为控制AS的形成或病变部位．比较有利于对AS的并发症脑卒中的研究，但此种造模方法的缺点是对实验人员的操作技术要求较高，且手术中的不稳定因素较多，在大鼠造模中的个体差异较大，不易形成稳定的AS病变和统一的AS模型。 ApoE基因敲除小鼠构建AS模型 血脂异常是AS的主要危险因素，ApoE是血浆脂蛋白的重要成分，对脂质的运输和代谢发挥重要作用。有研究者用饲养8周龄的载脂蛋白E基因敲除雄鼠给予高脂饲料（脂肪15%、胆固醇1.25%、0.5%胆酸盐）饲养8周，表现为TG、TC、和LDL-C显著升高（p＜0.05），HDL-C（p＜0.05）显著降低，主动脉形成明显的AS斑块。 效果评价 从AS的发病机制出发，脂类沉积、血管钙化、炎症、免疫机制或机械损伤引起内膜受损是建立大鼠AS模型的前提．各种构建AS动物模型的方法在模型形成时间、动脉硬化程度及病变发展上都有所不同。应根据研究目的来选择。 就以上所述的几种建模方法而言，纯高脂饲料喂养很难导致AS病变，且造模周期较长；高脂饲料结合维生素D诱导只是导致大鼠形成AS早期的病理状态．并没有形成成熟的与人类病变相似的AS斑块；大鼠高脂饲料喂养及维生素D损伤的同时，结合手术机械损伤作用可形成与人类AS相似的较成熟的AS斑块。基于对ApoE基因敲除小鼠AS模型的构建及相关研究，有利于更深入的研究疾病的发生机制。 随着研究学者们对AS的不断深人了解与探究，相信一定会有一种比较完美的规范的与人类病理状态相似的动物AS模型。 |
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