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NanoFCMlxq

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外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（二十）
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今天分享一篇发表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，名为《Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry》[1]（用纳米流式检测技术分析单颗粒水平的细胞外囊泡DNA）。

细胞外囊泡(EVs)是几乎所有细胞类型都分泌的纳米级膜囊泡，通过将蛋白质、核酸和脂质从供体细胞转移到受体细胞来介导细胞间通信。最近的研究表明，EV中存在基因组DNA、线粒体DNA甚至病毒DNA。通过DNA的包装和水平转移，EV在维持细胞稳态、调节免疫反应和调节肿瘤进展中发挥着关键作用。最近，基于EV-DNA的液体活检诊断癌症的技术已被开发。虽然EV-DNA的生物学意义已被认识到，但对EV-DNA的研究较少，许多基本特征仍存在争议，如DNA是否与所有或某些EV亚群相关？EV-DNA是否位于EV的腔内和/或表面？DNA含量与EV大小之间有什么关系？EV-DNA是单链DNA(ssDNA)还是双链DNA(dsDNA)？

EV-DNA研究通常通过从EV分离物中提取DNA，然后进行丰度、片段长度和序列评估。通过将DNase酶解与片段分析系统相结合，研究了DNA的相对丰度和定位(在腔内或与EV表面相关)。为了明确EV亚群间EV-DNA的异质性，我们对密度梯度离心或非对称流场流分离的EV进行了DNA分析。有研究者发现，通过使用自底而上的碘二醇密度梯度，从细胞培养基中分离出的高密度和低密度小EV(sEVs)都含有DNA，而高密度sEVs比低密度sEVs携带更多的DNA。然而，使用类似的方法，有人发现EV分离物中的DNA与非囊泡性实体相关，而不是与EV相关。尽管批量分析法可以识别不同EV亚群中的DNA，但由于EV-DNA不能与游离DNA区分，包括与EV共分离的非囊泡状颗粒相关的裸DNA。由于EV在大小和内容物含量上差异很大，迫切需要单颗粒分析技术来解读EV-DNA的巨大内在异质性，并将EV-DNA与游离DNA或其他污染物区分开来。然而，EV的纳米级颗粒尺寸(大部分小于100nm）以及极低的内容物含量是一个巨大挑战。

在过去的十年里，我们的实验室一直致力于开发一种高灵敏度的纳米流式检测仪(nFCM)。实现了单个EV、病毒、二氧化硅纳米颗粒和金纳米颗粒的光散射检测，最低粒径分别为40nm、27nm、24nm和7nm。在荧光(FL)检测中，检测单个R-藻红蛋白分子的信噪比为17，对有机染料的检测限为3个AlexaFluor532分子。在本研究中，我们试图通过结合酶解和nFCM，在单囊泡水平上分析外部和内部的EV-DNA。研究了DNA+EV的百分比、DNA含量分布与EV大小的关系、ssDNA与dsDNA的区分、EV-DNA与组蛋白的关联以及抗癌药物治疗后DNA含量的变化。

研究结果：

一、EV的分离和特征分析

以培养的HCT-15细胞上清液作为模型系统，通过10万×g超离心从CCCM中分离EV(图1(a))。分别采用TEM和Western blot检测EV的形态和EV制备过程中蛋白的存在。图1(b，c)显示了EV的良好恢复率。为了定量EV的纯度，实验室建造的nFCM可以检测小至40nm的EV的侧向散射光，对比TritonX-100处理前后1 min收集的颗粒数 。图1(d)显示了一个典型的用TritonX-100处理前后的侧向散射(SSC)爆发面积分布直方图。从每个EV样品中扣除在相同设置下测量的PBS颗粒数，得到EV分离物的纯度为86%。为了检测EV的粒径，使用nFCM在相同的仪器设置下对47、57、59、74、95和123nm的单分散混合硅纳米颗粒(SiNPs)进行分析。SSC分布直方图如图S1(a)所示。考虑到在488nm激发下，SiNPs（1.463）和EVs（1.400）的折射率差，根据Mie理论对SiNP标准的每个尺寸，计算了SiNP散射的光与相同粒径的EV的强度比。将这些比值作为校正因子，从SiNPs数据中推导出散射光强与粒径之间的校准曲线。图1(e)所示的EV大小分布直方图显示，从HCT-15细胞CCCM中分离的EV主要在40-200nm范围内。峰值位置和中位数分别为50和63.3nm。这些值与我们之前报道的使用超离心法从HCT-15细胞的CCCM中分离出的EV的50和64.5nm的值一致。

二、从细胞培养基中通过超离心制备的EV样品中存在大量游离DNA

如图2(a)所示，分离的EV用膜透性核酸染料SYTO 16标记，并在nFCM上进行分析。同时检测到单个EV发出的SSC和绿色FL信号。通过在1-2个min中分析数千个EVs，可以快速获得核酸绿色FL强度与SSC强度的双变量点图。为了对EV-DNA有更高的灵敏度和选择性，筛选了6种核酸染色，包括SYTO 9、SYTO 13、SYTO 16、PicoGreen、SYBR GreenI和SYTO 82。这些染料与DNA或RNA结合的发射光谱数据表明SYTO 16与DNA的结合选择性最高，并具有良好的FL信号强度。

为了检测nFCM对DNA的灵敏度，对含有400、2000和5000碱基对(bp)的DNA片段用SYTO 16染色，并在单个DNA片段水平上进行分析。图2(b)(i)显示了一个具有代表性的FL信号，它显示了峰值高度聚集在三个不同的振幅水平附近，这与三个不同大小的DNA片段相对应。图2(b)(ii)所显示的FL突发面积分布直方图显示，长度为400bp的单个DNA片段可以很好地分辨出来，得到片段长度与FL强度之间的线性关系(r2=0.999)。根据背景标准差的三倍和3个bins的峰值宽度(0.3 ms)计算出检测限为185bp。这些数据不仅证实了插入染料分子可对DNA进行化学计量，而且表明nFCM对单个EV中DNA含量的定量分析具有很高的灵敏度。需要注意的是，单个EV的DNA是由不同长度的DNA片段组成的，每个长度的DNA片段可能有不同的拷贝数，只要单个EV的总DNA片段长度大于～200bp，nFCM可以将EV-DNA与背景区分开来。

然后，我们根据MIFlowCyt-EV指南，通过nFCM分析SYTO 16染色的EV。图2(c)显示了染色EV样本的代表性SSC和FL信号。与同时有FL和SSC信号的事件相比，有更多的事件（其中几个用星号*表示）只显示FL信号。这些事件可以是裸DNA或与非囊泡性实体相关的DNA，如与EV共同分离的无法被nFCM检测到SSC信号的蛋白质。这些DNA随后被表示为游离DNA。同时，偶尔会观察到只有SSC信号而没有同时出现的FL信号（用?表示）的事件，如图2(c).所示这些事件可以归因于DNA阴性(DNA-)EV或缓冲液或鞘液中的杂质颗粒。用通过220nm膜过滤的PBS作为样品，测量杂质颗粒的事件率为217±7/min。图2(c)(iii)显示了仅有FL和同时有FL和SSC信号的分布直方图。这两个群的FL强度中位数分别为1280和2707。在3个重复实验中，仅检测到FL信号的事件占所有可检测到FL的事件为61.6±2.5%，甚至高于同时检测到FL和SSC信号的事件（38.8±2.5%）。另外，对100,000×g超离心前后的lambdaDNA片段(48.5kbp)进行的nFCM分析表明，在超离心后，裸DNA片段可以很好地保留在溶液相中。

三、在EV-DNA定位和EV大小方面存在两个EV群体

图3(a)显示了一个EV分离物的代表性SSC和FL信号，以及SYTO 16 FL强度与SSC的双变量点图。与图2(c)(i)和(ii)相似，可以识别出三个不同的群体，特别是在图3(a)(iii)中具有统计学意义的点图中，仅有FL、仅有SSC和同时有SSC和FL的事件分别代表游离DNA、碎片/DNA-EV和DNA+EV。对于DNA+EV，单个EV的DNA含量大约有三个数量级的变化。此外，DNA+EV可以沿对角线分为两个部分，即SSC低/SYTO 16高和SSC高/SYTO 16低。根据MIFlowCyt-EV指南，洗涤剂对照可用于确定检测到的事件是EV还是非EV实体。在使用1% tritonX-100裂解EV后，DNA+粒子(可检测到SSC信号)事件率从2907±184下降到286±138，DNA-粒子事件率从2231±154下降到307±134。值得注意的是，这种TritonX-100处理基本上不会使无囊泡的DNA变性或分解DNA。这些结果表明，nFCM检测到的90%的DNA+事件是EV，而不是与DNA相关的大型非囊泡实体。同时，86%的DNA-事件是DNA-EV，而不是杂质粒子。

为了确认附着在EV外膜上的DNA的存在，在SYTO 16染色和nFCM分析之前，我们用DNase I处理EV，这是一种内切酶，通过水解磷酸二酯键非特异性地酶切ssDNA和dsDNA。通过优化，使用0.2-U/μl无RNAse的DNaseI处理EV。具有代表性的SSC和F信号(图3(b)(i)和(ii))表明，在DNaseI处理后，与图3(a)(i)和(ii)相比，最初丰富的仅有FL事件消失了。有统计学意义的双变量点图SYTO 16 FL强度与SSC相比(图3(b)(iii))表明，在DNase I处理后，游离DNA群体和SSC低/SYTO 16高的DNA+EV亚群几乎完全消失。为了验证DNase I处理后EV结构的维持，我们对三种经典的跨膜蛋白CD9、CD63和CD81进行了免疫荧光标记。DNase I消化前后的SSC和FL信号均无明显变化。这些结果表明，本研究中使用的DNaseI处理方案促进了EV外部DNA的有效消化，同时保持了EV的结构和完整性。考虑到只有EV内的DNA才能被保护避免被酶消化，SSC低/SYTO 16高的DNA+EV亚群可以被鉴定为DNA主要附着在外表面的EV。为了排除在超离心过程中DNA和EV被迫聚集的情况，我们直接用SYTO 16对CCCM进行染色，并使用nFCM进行分析。CCCM的DNA+颗粒百分比为30.0%。用DNase I降解外DNA后，DNA+群体的比例下降至6.5%。同时，使用1%的TritonX-100在CCCM中溶解EV，可检测到SSC信号的DNA+粒子的事件率从2554下降到240。这些结果表明，在CCCM中检测到的DNA+颗粒主要是EV，在超离心过程中，DNA自然分布在EV表面，而不是被迫聚集在EV表面。

为了便于解释EV-DNA与EV大小的相关性，我们根据上述程序(图1将SSC强度转换为EV大小)，忽略游离DNA。图3(c)(i)和(ii)所示的SYTO 16FL强度与EV大小的双变量点图表明，在所有可检测到SSC信号的事件中，经DNase I处理后，DNA+EV的百分比从60.6%下降到26.0%。DNase I处理前后DNA+EV粒径分布和SYTO 16 FL强度的分布直方图见图3(c)(iii)和(iv)。显然，对于从HCT-15 CCCM超离心获取的EV，表面有DNA附着的EV尺寸相对较小（40-100nm），且包含更多的DNA含量，而内部封装DNA的EV相对较大，大约从80到200nm，包含更少的DNA含量。外DNA+EV和内部DNA+EV的FL强度中位值分别为2350和750，表明EV表面的DNA多于腔内。还以含有400、2000和5000bpDNA片段的混合物作为外标准，估计了单个EV的总DNA长度，并确定了200~550,000bp的大变异。

虽然SYTO 16对DNA染色的偏好更大，但它也轻微地标记了RNA。为了实现DNA的高度选择性标记，通过代谢生物合成途径将乙基修饰的dUTP(EdU)纳入新合成的DNA中，然后通过链接化学与azide-AF488进行化学选择性偶联(图3d(i))。使用常规流式进行的单细胞分析显示，EdU成功融入细胞，91.7%的细胞EdU阳性。然而，由于单个EV的DNA含量较小，只有11.3%的EV为EdU阳性(图3(d)(iii))。然而，在DNase I消化后，该群比例下降到3.0%，显示显著下降的DNA+EV相对较小，相对较大的EV几乎没有变化。EdU掺入实验证实了用SYTO 16染色观察到，内部DNA主要被尺寸相对较大的EV封装在腔内，而外部DNA主要与相对较小的EV有关。

为了测量EV-DNA的片段长度，EV被分为两个等分：一个用DNase I处理，另一个在DNA分离前保持不处理。对未经DNase I处理的EV中提取的DNA进行芯片毛细管电泳显示，总DNA范围在1000~50000bp之间(图3(e)(i))。在这一阶段，不添加DNase I，DNA含量就包括表面附着和囊内DNA以及与EV共分离的游离DNA。在使用DNase I消化囊外DNA(外部EV-DNA和游离DNA)后，发现内部EV-DNA在200-1200bp的范围内。由于内部EV-DNA的含量极低，内部DNA通过快速真空冻干法浓缩了10倍，并与未浓缩的样品平行分析。值得注意的是，我们试图通过尺寸排除色谱(SEC)或密度梯度超离心法获得无游离DNA的EV，以进一步纯化超离心法获得的EV。nFCM的单粒子分析表明，SEC很难从EV中分离出游离DNA。虽然密度梯度超离心法可以有效地从EV中分离出游离的DNA，但由于严苛的分离过程，粘附在EV表面的EV-DNA大部分与表面分离。

四、内外EV-DNA ssDNA和dsDNA的原位分析

为了确定外部EV-DNA是ssDNA还是dsDNA，用DNase I、dsDNase(针对dsDNA)或S1核酸酶(针对ssDNA) 处理或不处理的EV，用SYTO 16进行标记，并在nFCM上进行分析。以纯化的lambdaDNA和ssDNA寡核苷酸为底物，验证了dsDNase和S1核酸酶的功能和特异性。图4(a)显示了在可检测到SSC信号的事件中，未处理或使用不同DNA酶处理的EV的SYTO 16 FL与粒径的双变量点图。经DNaseI消化后，DNA+EV的比例从未处理的59.9%显著下降到26.4%，与图3(a，b)的结果一致。用dsDNase预处理也导致DNA+EV比值显著降低到29.4%，与DNaseI处理相似。与此同时，经S1核酸酶处理的EV（62.1%）与未处理的EV样品（59.9%）相比，没有显著变化。三次重复实验的结果如图4(b)所示，说明外部EV-DNA主要是双链的。

图4(c)显示了内部EV-DNA的ssDNA和dsDNA之间的原位分化示意图。首先用DNaseI消化外部EV-DNA，然后将EV固定透膜，并不使用或使用不同的DNase进行处理。图4(d)(i)显示，DNaseI处理后固定和渗透后，DNA+EV的百分比为27.0%。图4(d)(i)和4(a)(ii)中DNA+EV和EV分布的可比性群体表明，EV膜固定和渗透过程对EV结构完整性的影响可以忽略不计。当用DNaseI消化内部EV-DNA时，DNA+EV的群体比例显著下降到7.2%(图4(d)(ii))。当用dsDNase处理内部EV-DNA时，观察到DNA+EV的事件显著下降（至5.7%）(iii)。同时，S1核酸酶处理几乎没有导致DNA+EV群体的减少(iv)。每种样本类型的三次重复实验的数据如图4(e)所示。这些结果表明，dsDNA是内部EV-DNA的主要形式。

五、抑制外泌体分泌减少了DNA主要附着在外表面的相对较小的EV的数量

图3和图4显示，似乎存在两群EV，相对较小的EV（40-100nm）主要携带长的和更多的DNA片段附着在外表面，而相对较大的EV（80-200nm）通常有短和更少的DNA片段(0.2-2kbp)封装在内部。为了研究外部和内部EV-DNA是否来自不同的生物发生途径，我们使用中性鞘磷脂酶的特异性抑制剂GW4869抑制外泌体分泌，处理HCT-15细胞24小时。图5(a)显示，随着GW4869浓度的增加，从HCT-15细胞CCCM中收获的EV数量减少，直到达到10-μM GW4869时为原始值的50%。图5(b)显示，10-μM GW4869处理后，DNA+EV的比例从DMSO对照的48.4%下降到19.4%，DNA含量降低的EV主要是小于100nm的EV。这些结果与外泌体主要是小EV的观点相一致。然后对有无GW4869处理的EV进行DNase I处理。将图5(b)(i)和5(c)(i)中所示的SYTO 16 FL与EV大小的双变量点图进行比较，显示了与图3(a，b)中观察到的相似的现象。对于大多数小EV，DNA主要附着在外表面，经DNaseI处理后降解；然而，对于大多数大EV，DNA主要封闭在EV内，并能很好地免受DNaseI消化的影响。当比较图5(b)(ii)和5(c)(ii)时，从GW4869处理的细胞中分离的DNaseI消化前后的DNA+EV群体没有显著差异(19.4% vs 17.7%)。这些结果表明，当细胞在GW4869中培养时，外泌体的分泌受到大量抑制。由于其余的EV相对较大(80-200nm)，DNA主要被封闭在腔内，DNaseI消化对分离的EV的影响最小。这一群体可以归因于从质膜直接出芽形成的微囊泡。每个处理的三次重复实验的结果如图5(d)所示，当10-μM GW4869抑制外泌体分泌途径时，DNA附着或DNaseI处理后消失的EV种群从最初的38.4%（51.8%–13.4%）显著下降到5.7%（22.0%–16.3%）。

六、组蛋白(H3)在EV中没有发现，EV-DNA与组蛋白无关

以上数据表明，相对较小的EV(＜100nm)主要包含附着在表面的DNA。为了研究这种粘附是否通过膜蛋白的粘附，分离的EV用蛋白酶K处理，用SYTO 16染色，并在nFCM上进行分析。图6(a)显示，DNA+EV的比例从未处理的60.4%下降到37.4%，说明在蛋白酶K处理后，23.0%的EV的DNA从EV表面脱落。将这种分离率与DNaseI处理的33.5%(61.4%–27.9%，图4(b))降解率进行比较，可以发现大多数EV-DNA出现在外表面是通过附着在外膜蛋白上的。由于在EV中已经发现了DNA结合组蛋白，本研究检测了EV-DNA和组蛋白之间是否存在任何关系。Western blot分析证实了EV制剂中存在组蛋白H3(图6(b)(i))，免疫金透射电镜分析显示，组蛋白H3主要与EV的小的非囊泡状颗粒有关，而不是EV的外表面(图6(b)(ii))。为了确定组蛋白是否存在于EV表面或内部，免疫表型通过将荧光标记抗体与无或有膜通透的EV孵育。4%PFA固定后，用含0.2%Tween20(v/v)的PBS渗透EV膜，用β-actin，一种主要在EV腔内恢复的细胞骨架蛋白，而不是EV外膜，作为阳性对照。图6(c)(ii)和6(d)(ii)显示，EV膜通透后，β-actin+EV的种群比例从12.0%增加到52.9%，表明EV膜通透和腔内蛋白标记效率良好。另一方面，对于H3+EV有无进行EV膜透的百分比相当(2.0%vs.1.8%)(图6(c)(iii)和6(d)(iii))，接近其相应的同型对照水平(图6(c)(i)和6(d)(i))。此外，对HCT-15细胞的常规FCM分析显示，细胞中存在组蛋白H3，并且所使用的单克隆抗体有利于组蛋白H3的标记。因此，这些结果表明，在EV中没有发现组蛋白；然而，它们和与EV共分离的非囊泡状颗粒有关。因此，EV-DNA与组蛋白无关。

七、抗癌药物诱导DNA+EV数量和个体EV中DNA含量的增加

EV通过从细胞中提取有害的细胞质DNA，在维持细胞稳态方面发挥着重要作用。据报道，癌细胞分泌的EV比正常细胞释放的EV携带更多的DNA片段。本研究对两对正常和肿瘤细胞系CCD-18Co和人结直肠癌细胞系HCT-15、人鼻咽癌上皮细胞系NP69和鼻咽癌细胞系C666-1进行EV-DNA比较。通过比较正常细胞和癌细胞分泌的DNA+EVs的数量，发现癌细胞分泌的DNA+EVs的比例显著较高(CCD-18Co，35.1±8.4%；HCT-15,57.3%±3.0%；NP69,34.4±5.6%和C666-1,82.7±6.4%)(图7(a))。经DNaseI处理消化外部EV-DNA后，正常细胞和癌细胞之间的DNA+EV的百分比相当(CCD-18Co，20.1±4.6%；HCT-15,25.2%±1.5%；NP69,20.5±2.2%和C666-1,24.5±6.0%)(图7(a))。这些数据表明，由于其固有的基因组不稳定性，癌细胞比正常细胞分泌更多的DNA+EV，而这种差异主要是由于外部DNA+EV比例的差异。

越来越多的证据表明，抗肿瘤药物可诱导相当大的染色体不稳定和细胞衰老。因此，癌细胞通过释放大量携带更多DNA含量的EV来维持细胞，从而改变其EV分泌谱稳态。为了检测单EV水平上的EV-DNA变化，我们用基因毒性药物依托泊苷(拓扑异构酶II抑制剂)(100μM)、SN-38(拓扑异构酶I抑制剂)(10μM)或拓扑替康(拓扑异构酶I抑制剂)(20μM)处理HCT-15细胞。在任何一种药物治疗后，含有DNA的EV数量显著从对照组的45.8%(0.02%DMSO)显著增加到依托泊苷、SN-38和拓扑替康的75.1%、71.0%和77.2%(图7(b))。此外，与个体EV中DNA含量对应的中位FL强度也从对照组的620显著增加到依托泊苷、SN-38和拓扑替康的2464、1812和1496。这些结果表明，抗癌药物治疗后，单个EV的DNA数量和DNA+EV数量均增加。为了研究药物治疗后内部EV-DNA的变化，在SYTO 16染色前，我们使用DNaseI消化外部EV-DNA。图7(c)显示，在两种药物治疗后，内部DNA+EV的数量显著增加(0.02%DMSO，24.0%；依托泊苷为36.7%；SN-38为39.6%，拓扑替康为40.5%)。同时，中位FL强度也显著增加（0.02%DMSO，440；依托泊苷，841；SN-38,980和topotecan，785）。每个处理的三个重复实验的数据如图7(d)所示。0.02%DMSO、100μM依托泊苷、10μM SN-38和20μM拓扑替康的DNA+EV的百分比分别为42.0±3.3%、79.2%±2.3%、75.3±3.6%和75.9±4.6%。经DNaseI处理后，0.02%DMSO、100-μM依托泊苷、10-μM SN-38和20-μM拓扑替康的内DNA+EV的百分比分别为22.3±2.4%、36.4%±5.5%、38.9±5.0%和41.9±4.1%。

文章就分享到这里，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Liu Haisheng,Tian Ye,Xue Chengfeng,et al.Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry.Journal of extracellular vesicles.2022;11 (4)：e12206.doi:10.1002/jev2.12206

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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
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36楼2022-08-11 10:55:52
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NanoFCMlxq

新虫 (正式写手)
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36楼: Originally posted by zhangxiwu123 at 2022-08-11 10:55:52
求更新

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zhangxiwu123
37楼2022-08-13 10:35:14
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铁首星空2楼
2022-07-02 18:31   回复  
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tzynew5楼
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Jzhang2136楼
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wolaile7楼
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2012csc8楼
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kyxzyq9楼
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zhulei032410楼
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秋土豆香11楼
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XueMF081912楼
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chenhu918217楼
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wewer18楼
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gordon39919楼
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rh1990112020楼
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haorongrong21楼
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y1987yuyu22楼
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nono200923楼
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rmcqh24楼
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bodygb26楼
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hikingman27楼
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weiylwyl28楼
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baihualongma29楼
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chenhuanlong30楼
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bluesky999935楼
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zhangxiwu12338楼
2022-08-15 10:47   回复  
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引用回帖:
37楼: Originally posted by NanoFCMlxq at 2022-08-13 10:35:14 多谢支持！我会努力 ...

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