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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR问题求助？
汕头大学海洋科学接受调剂
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zhang6871

银虫 (正式写手)

[交流] PCR问题求助？

在设计引物预作PCR时，如果目的基因的mRNA长3000bp，那么设计引物的时候使扩增片段位于什么区间有没有什么不同呢？比如，位于1-1000bp间，1000-2000bp间，2000-3000bp间，扩增的效果会不会有什么大的区别呢？恳请有经验的虫友解答一下。谢谢！
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过于功利，浮躁，布满灰尘的心都是创新的杀手!多记，心静，多动手，贴近大自然!
1楼 2009-09-09 23:07:39
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木木803

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引物设计一般依照引物退火温度，产物退火温度，还有引物结构，有没有二聚体等条件，建议你用一些软件如Oligo，Primer Premier等来设计
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3楼2009-09-10 11:39:49
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zhouhuaxi

铜虫 (正式写手)
★
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肯定是有区别的，3000BP的片段，一定会有二级结构的。如果你刚好设计在二级结构上的话，退火温度肯定要高一些。还有就是取决于你的逆转引物是什么，OLIGODT是从POLYA开始的，可能会由于二级结构的阻碍导致逆转不彻底，那么设计在上游例如1-500范围内，有可能扩增不成功。
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4楼2009-09-10 16:08:19
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yxx41

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个肯定是有区别的啊，但是有多大就不好说了。楼上二位说的挺好啊，你完全可以摸索一下啊
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内事不决问百度，外事不决问Google，横批：wikipedia
5楼2009-09-10 19:01:10
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yangxiaofei

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议1 不要设计在5‘或者3'端，因为在这两段往往涉及RNA Processing°radation的特殊结构，设计在这些位点可能会造成PCR不成功，偏中间的序列往往比较保险，建议在各个区段各设计一对，看哪对能P出来。3K也不是很长，不会特别难做。
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6楼2009-09-10 22:44:04
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