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外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十九）
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今天分享一篇发表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，名为《Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour》[1]（活跃的货物加载到细胞外囊泡：突出了异质性的封装行为）。

细胞外囊泡(EVs)是具有脂质双层外壳和包含生物分子的生物纳米颗粒，来源于大多数细胞类型以调节细胞间通信。EV作为天然分泌的纳米囊泡，因为其固有的生物相容性、合适的尺寸和固有的细胞靶向能力，在药物传递领域显示出了巨大的潜力。。迄今为止，已有几项基于EV的临床前试验研究了输送蛋白质、RNA或其他化疗药物治疗疾病的能力。

尽管EV治疗具有独特优势，但仍有一些挑战有待解决。使用EV作为输送载体，稳定封装大量治疗分子是先决条件。目前，主要载药方法分为两类：预装载和后装载。预装载通过将小分子药物与亲本细胞共孵育，或转染药物编码DNA到亲本细胞，然后分离分泌的自然携带治疗分子的EV。然而，这种方法仅限于培养细胞来源的EV，很难应用于其他来源，如血浆或食物。对于后装载的方法，药物可在被动或主动刺激下，如孵育、超声、冻融和电穿孔，载入纯化的EV。尽管如此，与人工方法相比，上述所有方法都遇到了一个共同的问题：装载能力较差，特别是对于亲水分子的封装。因此，开发更先进的装载方法来促进治疗药物的封装是基于EV的药物给药的重要环节。

此外，对货物封装行为的综合评价对新型载药方法的开发具有高度的指导意义，这往往被忽视。受限于技术的敏感性，目前大多数研究是通过从体积分析而不是单粒子基础外推来评估加载能力。例如，一个常用的参数，封装效率，被定义为整体纳米载体合并载药量与初始输入的比率。然而，EV在颗粒大小和分子含量上自然异质性，经常被共沉淀蛋白和其他杂质污染，从而导致药物封装不平等。因此，未知的异质性需要在单粒子水平上进行定量表征，以评估甚至纯化载药EV。

针对基于EV的给药系统中的这些挑战，我们提出了一种高效的载药方法，名为“超声和挤压辅助主动负载”(SEAL)，用于封装可电离的亲水药物。以牛奶衍生EV(mEVs)和阿霉素(DOX)为模型系统，SEAL的药物包封效率明显高于传统方法。此外，我们开发了一种用于评估加载行为的单粒子方法，其中引入了具有纳米级灵敏度的流式仪(nFCM)来量化封装效率并揭示异质性。通过多参数分析，揭示了mEVs的封装异质性与成分方差之间的相关性，进一步指导了纯化过程中去除不需要的组分，提高纯度。

研究结果：

一、用SEAL制备Dox-mEVs

基于跨膜离子梯度的活性载药是脂质体纳米药物药物包封最高效的方法之一。受此启发，我们提出了SEAL方法，以mEVs和阿霉素为模型系统，以增加EV的载药能力(图1a)。将mEVs在硫酸铵 ((NH4)2SO4)中重悬和超声，以暂时渗透膜，促进溶液流入管腔，以建立主动加载所需的跨膜铵梯度。然后，进行挤压，缩小大的mEVs，使颗粒大小均一，重塑不利于载药和递送的非球形或多层囊泡。然后用PBS透析散装溶液，然后用阿霉素孵育进行活性负荷。

为了确定SEAL的效率，我们用TritonX-100对Dox-mEVs样品进行裂解，释放管腔聚集的阿霉素，并检测荧光信号(图1b)。与被动孵育相比，由于药物封装更有效，荧光强度增加了10.5倍。显著的荧光猝灭，即释放的和mEVs封装的阿霉素之间的荧光强度比，进一步证实了更多的药物在SEAL制备的mEVs腔内累积。在脂质体模型中获得了一致的结果，其中阿霉素封装进行了类似的过程。通过Western blot检测SEAL过程前后mEVs上CD81、CD63、CD9、TSG101和HSP70的蛋白标记物，发现超声和挤压处理没有显著影响mEVs的蛋白含量。

接下来，我们试图优化SEAL的技术参数，以改善载药量。首先，我们发现SEAL过程的性能与盐浓度和超声时间高度依赖，在2-4min超声和0.5-1M硫酸铵溶液条件下效率最佳(图1c)。延长超声处理时间或更浓缩的溶液都不能在不影响结构完整性的情况下提高封装效率。我们还研究了挤压操作的影响，结果显示，超声处理后的3个挤压循环足以减小mEVs的尺寸，提高封装效率(图1d)。使用没有超声处理的单独挤压处理的额外试验进一步验证了挤压过程确实促进了mEVs膜上的溶液交换，并促进了主动加载过程。此外，根据不同浓度阿霉素标准溶液的荧光校准曲线，对不同药物输入下的加载浓度(mEVs加载阿霉素浓度)和封装效率(mEVs封装阿霉素与初始阿霉素输入的比值)进行量化。当阿霉素的初始浓度低于0.5mM时，负荷浓度与药物输入之间存在明显的正相关关系(图1e)。随着药物输入的不断增加，负荷浓度保持不变，因为额外的阿霉素不再被限制在mEVs的腔体积。相应地，在计算不同药物输入条件下的药物包封效率时，则观察到相反的趋势。除药物输入的影响外，mEVs浓度与负载能力之间也存在正相关关系。

此外，与被动孵育、超声、冻融、电穿孔等传统方法相比，验证了SEAL的加载能力(图1f)。通过动态光散射(DLS)测定了Dox-mEVs样品的粒径、多分散性指数和zeta电位，表明在载药时没有明显的聚集或电荷逆转(图1f)。此外，采用透析袋法分析药物释放动力学。与传统的孵育方法相比，SEAL制备的Dox-mEVs样品的延迟释放谱验证了其增强的封装稳定性(图1g)。

此外，通过透射电镜观察了Dox-mEVs的形态学特征(TEM，图1h)。与未负载的mEVs相比，在SEAL制备的Dox-mEVs的囊泡核中观察到一个代表阿霉素沉淀的电子密集结构，这与脂质体对应物的特征一致。同时，透射电镜图像也显示了mEVs与其他非囊泡粒子共存。为了解决SEAL的普遍性，一种化疗药物米托蒽醌(MXT)和一种核酸结合荧光染料吖啶橙(AO)也被积极地加载到mEVs中。

二、用nFCM对Dox-mEVs进行单颗粒分析

考虑到TEM的过程耗时、分析通量低和潜在的成像伪影，应用nFCM系统更彻底地揭示了异质性，可对SEAL制备的Dox-mEVs负载能力的进行定量。当单个粒子依次通过nFCM的紧密聚焦的激光束时，同时检测到侧散射(SS)和阿霉素荧光(FL-Dox)信号。图2a显示了通过被动孵育和SEAL制备的Dox-mEVs的代表性SS和FL-Dox的信号。对于被动孵育样品，没有颗粒有装载足够数量阿霉素可发射nFCM可检测到的荧光信号(图2a-i和ii)。对于SEAL制备的样品，SS和FL-Dox通道上检测到的峰代表了主动负载的Dox-mEVs亚群，装载了大量药物。同时，没有可检测到的FL-Dox信号的粒子也同时存在，可认为是非/负载较差的亚群。为了从单粒子的角度更定量地表征载药能力，我们引入了一个称为“活性载率”的参数，作为描述活性载亚群百分比的度量。根据1分钟检测得到的FL-Dox与SS的双变量散点图，计算出活性载率为18.2%，表明80%以上的颗粒不能主动封装阿霉素(图2b)。此外，“主动加载效率”，定义为阿霉素封装在单个粒子的平均分子数，通过nFCM的单颗粒检测结合总载药量的总体检测。如图2b所示，测得颗粒浓度和总载药含量分别为9.0×10^13颗粒/mL和162?M。结果表明，活性加载效率为每个颗粒1080个分子。假设与未/低负载亚群相关的阿霉素可以忽略不计，并且只考虑了主动负载的Dox-mEVs进行计算，则重新估计主动加载效率平均在5934左右。此外，SS和FL-Dox强度分布的统计学代表性直方图如图2c所示。与未/负载差的亚群相比，主动负载Dox-mEVs的亚群表现出增强的光散射，这要么是由于形态的改变，要么是由于药物封装后折射率(RI)的增加。此外，以二氧化硅纳米颗粒为标准，可以进一步分析这两个亚群的尺寸分布。在荧光检测方面，由于阿霉素积累显著，主动负载的Dox-mEVs的FL-Dox直方图可以与大多数未负载不良的亚群区分开来(图2c-ii)。总的来说，通过基于nFCM的单粒子分析，可以揭示和量化更全面的载药行为。

考虑到未/低负载颗粒的显著共存，采用超滤(UF)、尺寸排除色谱(SEC)和胰蛋白酶处理三种EV纯化方法对Dox-mEVs样品进行了纯化，并研究了其对活性负载率的影响。用nFCM测定了不同纯化过程下两个亚群的颗粒浓度，并据此计算了活性负载率(图2d)。结果表明，SEC和胰蛋白酶处理能够增加活性负载率，而UF纯化则导致样品的显著损失。我们还记录了SS和FL-Dox的强度，以确认在纯化过程中没有明显的药物释放或结构破坏(图2e)。除非另有说明，以下研究中使用的Dox-mEVs样品均由SEC纯化。

三、包封异质性与脂质包涵体的相关性分析

为了进一步阐明封装异质性与脂质包涵等结构特征的关系，采用双激光和三检测通道的nFCM进行多参数相关分析。通过同时散射和荧光测量，通过亲脂性碳氰染料DiD的荧光标记，可以将脂质包围的囊泡与其他颗粒区分开来(图3a)。通过SS和FL-DiD的的散点图结果显示，约50%的Dox-mEVs样本为DiD阳性，代表脂质包围的囊泡(图3b)。其中，还检测到一小部分（～5.9%）的DiD阳性颗粒，只有背景水平的SS强度，可能是染料聚集物或其他低于检测限的小颗粒(～40nm；图3b左上)。FL-DiD与FL-Dox的双变量点图显示，几乎所有具有可检测到的阿霉素信号的颗粒，即主动负载的Dox-mEVs，都是DiD阳性的(>95%，图3c)。因此，我们证明了只有具有脂质包涵体的颗粒是可主动加载的。同时，仍有37.6%的DiD阳性颗粒没有检测到FL-Dox信号(图3c的左上)。为了更清楚地展示样品的异质性，我们生成了一个包含三个子集的维恩图，显示了Dox-mEV样品中主动负载、脂质封闭和所有可检测粒子的粒子数(图3d)。此外，在表面活性剂辅助的破坏下，观察到FL-Dox和FL-DiD通道的事件率同时降低，进一步证实了脂质包涵与活性药物载量之间的直接相关性。

四、脂质探针介导的Dox-mEVs的磁性纯化

受上述结果的启发，我们引入了脂质探针介导的磁分离技术(LPMIT)，选择性地去除非脂质封闭颗粒，提高Dox-mEVs样品的纯度(图3e)。脂质探针DSPE-PEG-去硫生物素由一个带有两个疏水脂肪酸尾巴的聚乙二醇化脂质用于膜插入和一个用于后续亲和纯化的去硫生物素标签组成。经过“后插入”过程，去硫生物素标记的颗粒可以被链霉亲和素包被的磁珠富集，并通过游离生物素的竞争性结合进一步释放。然后用nFCM对纯化的Dox-mEVs样品进行表征，显示活性负载率增加到63.2%(图3f)。综上所述，几乎所有的活性可加载颗粒都是脂质封闭的，因此，脂质探针介导的纯化可以纯化Dox-mEVs样品，增加活性加载率。

五、Dox-mEVs中酪蛋白成分的识别和去除

牛乳中含有大量酪蛋白，使mEVs的纯化和应用更加复杂。虽然酸沉淀已被证明可以有效去除大部分单体酪蛋白，但酪蛋白成分的潜在残留很难完全消除。因此，将LPMIT纯化的Dox-mEVs样品用抗酪蛋白的荧光抗体进行免疫标记，并用nFCM进行分析。在可检测的事件中，免疫荧光阳性颗粒的百分比为～为33%，证实了酪蛋白成分的存在(图4a)。通过对FL-Dox与酪蛋白(FL-Cas)免疫荧光的相关性分析，我们发现超过85%的FL-Cas阳性颗粒不能主动装载阿霉素(图4b左上)。同时，大多数主动加载的亚群被确定为FL-Cas阴性(图4b的右下)。通过整合相关信息，我们生成了一个维恩图来说明LPMIT纯化的Dox-mEVs样品的异质组成(图4c)。为了去除所观察到的酪蛋白成分并增加活性负载率，提出了一种免疫磁性分离技术(IMIT)(图4d)。将磁珠与酪蛋白抗体偶联，可以选择性地去除这些组件，而不影响Dox-mEVs的结构完整性。最后，纯化的Dox-mEVs样品的活性负载率进一步提高到83.6%(图4e)。需要注意的是，尽管活性负载率显著增加，但由于在LPMIT过程中使用了过量的Dox-mEVs，超过70%的活性负载Dox-mEVs丢失。

六、负载mEVs的细胞毒性和细胞内化分析

为了证明由SEAL制备的装载mEVs的治疗潜力以及样品纯度对整体治疗性能的影响，我们进一步进行了一系列的细胞内实验。首先，采用CCK-8法评估SEAL制备的Dox-mEVs样品的细胞毒性。我们确定，空白mEVs的细胞毒性可以忽略不计，而Dox-mEVs表现出强大的细胞毒性反应，比脂质体对应的更显著(图5a)。由于缺乏活性靶向部分来促进HepG2细胞的积累，Dox-mEVs和Dox-LPs的体外细胞毒性低于游离阿霉素，这与之前的报道一致。然而，由于纳米级尺寸分布和独特的表面轮廓，EV配方可能具有更好的体内治疗效果。为了更好地说明SEAL方法的优越性，在相同的药物输入下，也通过不同的加载方法实现了阿霉素的封装，并平行评价了细胞毒性作用(图5b)。使用相同的蛋白质浓度，由SEAL制备的Dox-mEVs是确定EV剂量的一个常用参数，与其他方法相比，它表现出最显著的细胞毒性。此外，经上述过程纯化的Dox-mEVs处理的细胞活力低于未纯化的样品，因为载药率较高。

为了更好地分析细胞内化行为，mEVs通过SEAL装载AO，并通过NHS-胺反应进一步用荧光染料AlexaFluor647-NHS进行标记。将HepG2细胞与AO负载和AlexaFluor647-NHS标记的mEVs(AO-mEVs-AF647)孵育后，使用共聚焦荧光显微镜可以观察到绿色和红色荧光(CFM，图5c-i)。考虑到天然mEVs不足的细胞靶向能力，通过先前开发的基于蛋白质的修饰方法将广泛使用的癌症靶向配体转铁蛋白结合到AO-mEVs表面。与未修饰的mEVs相比，用转铁蛋白偶联样品(AO-mEVs-AF647-Tf)处理的HepG2细胞在AO和AF647通道上都显示出更强烈的荧光(图5c-ii)。荧光信号的明显亚细胞定位，其中AO位于核部分，AF647主要位于细胞质中，表明mEVs包裹的AO内化后从囊泡腔中释放出来。转铁蛋白偶联后Dox-mEVs增强的细胞毒性，进一步证实了配体促进的内化。

为了证明封装异质性对细胞内化行为的影响，我们制备了磁性纯化的AO-mEVs-AF647-Tf，并进行了平行分析(图5c-iii)。如CFM图像所示，纯化样品的AF647荧光与未纯化样品的荧光没有明显差异，而当使用相同的颗粒浓度处理细胞时，AO信号更强。未纯化样品的AO传递能力较差，是因为富含蛋白质的纳米污染物也很容易被转铁蛋白修饰，并通过受体介导的途径内化到宿主细胞中。因此，这种受体消耗效应将导致在单个转铁蛋白内化周期中，主动负载亚群的摄取减少。

此外，流式细胞术(FCM)分析也得到了类似但更定量的结果(图5d和e)。根据细胞荧光强度，转铁蛋白偶联的mEVs配方的AO递送能力约为未经修饰的对应配方的4倍。经过磁性纯化后，这种差异进一步扩大（～10倍）。转铁蛋白偶联也增加了AF647的强度，但在磁性纯化后略有下降，这可能与AO-mEVs-AF647-Tf与其他纳米污染物的标记程度不一致有关。综上所述，综合结果证明了SEAL制备的mEVs制剂具有优越的治疗性能，并揭示了药物封装异质性对治疗结果的潜在影响。

文章就分享到这里，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Chen Chaoxiang,Sun Mengdi,Wang Jialin,et al.Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour.Journal of extracellular vesicles.2021;10 (13)：e12163.doi:10.1002/jev2.12163

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