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求助，用CRISPR-Cas9一直敲不掉鲍曼的基因 已有2人参与
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CRISPR的实验已经开展了两个多月了，一直筛不出成功敲除的目标菌，快崩溃了 。参考的文章是CellPress的CRISPR-Cas9-Based Genome Editing and Cytidine Base Editing in Acinetobacter baumannii 一切按照说明书来，唯一的不同可能是我们把供体片段连接到pSGAb上了，因为担心供体和质粒一起电转效率不高。 在每一步质粒操作前都PCR验证过质粒上的关键片段，比如cas表达基因、RecAb重组酶表达基因、gRNA和供体片段，而且也经过测序证明序列没有问题。在几次重复的时候也更换过IPTG、更换过药板，也尝试延长诱导时间，但最后还是没有阳性菌。 筛选的时候一开始400ul电转完的菌液只取100ul来涂双抗板，后来无论是全部菌液涂几块板，挑96个，还是浓缩菌液后涂一个板然后调所有菌落（也长的不多，只有40~50个左右菌落），都没有筛出来阳性菌。 目前比较迷惑的问题： 1.是文章里写成果经过供体同源重组的话能产生一百多个菌落，但是我们的试验好几次都只有不到100个菌落，而且和两个对照（不把供体导入和只导入个原质粒）长出来的菌落数差不多，这是说明同源重组没有成功还是cas9没有切断目的位点？。 2.筛选的双抗板上长的菌长速明显有差异，有些菌落长得很快，养个过夜就有绿豆大小的菌落，有些又几乎养个48小时才长出来个针尖状的小菌落，但是检验过这些无论大的小的都是鲍曼，是什么原因？ 3.供体片段是不是不能连在pSGAb上一起转？是不是按照文章里面写的用单链供体片段和质粒一起转进去比较好？用不对称PCR来获取单链供体片段可行吗？ 希望有经验的兄弟指导指导，谢谢！！！ |
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liu5610372
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2楼2022-05-28 19:51:07
3楼2022-06-14 08:44:55
【答案】应助回帖
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楼主你好，我之前用过中科院杨晟老师开发的CRISPR/Cas系统做基因敲除。 关于你的第一个问题，我觉得只要板子上长出单克隆就行，不必追求单克隆的数目。因为不同的细菌种类，感受态浓度，电击条件等等都会影响最后长出的单克隆数目。 关于你的第二个问题，可能是因为单克隆之间的差异造成的。 关于你的第三个问题，我之前试过donor片段和sgRNA质粒一起共转，也试过将donor片段构建到sgRNA的质粒上再进行电转。我实验下来，感觉后面的方法效率更高，而且更加精确。 希望我的回答能够对你有帮助。rockwzh@163.com，这是我的邮箱，之后再有问题，可以再交流。 |
4楼2022-06-28 11:29:06
