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逸漠小略

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[资源] MSC细胞培养说明

脐带间充质干细胞是一种能分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的多能干细胞。其具有强大的增殖能力，且参与构成造血微环境，因此被广泛应用于组织工程，细胞治疗和基因治疗。

操作指南

常见问题

许多科研小伙伴，在培养MSC细胞时，可能会遇到一些问题，在这里小逸为大家梳理一下

MSC细胞培养操作指南

希望对老师们有所帮助（有需要采购可以看本人介绍）

产品参数

01

MSC细胞基本信息

MSC人脐带间充质干细胞

名称：MSC人脐带间充质干细胞

来源：脐带

特性：贴壁生长

形态：梭形细胞样

来源：IMMOCELL

支原体：无

推荐传代比例：1:3至1:5

推荐换液频率：2~3次/周

冻存液：无血清冻存液，液氮储存

规格：5x10^5cells/T25

培养条件气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃

MSC细胞培养基

人脐带间充质干细胞

完全培养基

流式鉴定&三系分化结果图

MSC细胞流式鉴定结果图

成脂

成骨

成软骨
到货处理

02

MSC细胞收货处理

复苏细胞T25瓶

复苏MSC细胞
1.收到MSC细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生及时和我们联系；

2.用75%酒精消毒瓶壁，将T25瓶置于37℃培养箱放置2-4h，显微镜下观察细胞状态；

3.给收到的细胞拍照(10x,20x)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。

收货注意事项

1.如果使用培养瓶，在将其放入培养箱前，应将封口膜去掉，瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换

2.仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致

培养指南

03

MSC细胞培养操作说明

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MSC细胞复苏步骤

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。

第二天换液并检查MSC人脐带间充质干细胞密度。

请客户用相同条件的培养基用于细胞培养

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MSC细胞传代操作

如果MSC细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若MSC人脐带间充质干细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

c、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

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MSC细胞冻存步骤

待MSC细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例

1.收集MSC人脐带间充质干细胞，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，然后进行细胞计数。

2.根据细胞数量对应加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10^6~1×10^7/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

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温馨小贴士

1.为防止回收培养基时操作造成污染，运输用的培养基（灌液培养基）建议不再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞

2.收到细胞后第一次传代建议1：2传代

常见问题

1、何时须更换培养基

视细胞生长密度而定，常规细胞2-3天更换培养基。

2、何时进行传代

细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养

首次传代建议1：2传代，就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

3、细胞冻存浓度是多少

1*10^6-1*10^7之间都可以。

4、冻存细胞数量计算

如果是有要求每管要冻多少细胞，那就用1ml完培重悬后，取部分按平时方法计数，剩下的细胞按计数需要的细胞量冻存即可

如果没要求，那就按平时，一个皿冻一管。

5、可否使用与原先不同培养基

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，易造成细胞状态不好，最终造成细胞无法存活。

6、可否使用与原先不同血清种类

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

7、影响细胞长得慢因素

A.没有保证密度，细胞长不起来

B.操作时力度没控制好，将细胞吹碎，状态变差

C.血清质量不好，影响细胞生长

8、贴壁不牢的细胞到货处理流程

A：到货后先稳定4-6小时将培养瓶内全部培养基收集到50ml管内，再用pbs润洗，pbs也收集到50ml管中。将上述上清1000rpm离心3min后，去上清，加入pbs重悬细胞沉淀。1000rpm离心3min后，去上清，加入胰酶1-2ml，重悬细胞沉淀，静置1-2min，加入2-4ml完培终止消化1000rpm离心3min后，将细胞铺到新的6cm皿或T25瓶中，镜下观察如有成团细胞，轻轻吹开即可。

B：T25瓶内贴壁细胞按正常步骤操作收集细胞即可。将A和B都一起铺到同一个皿里摇匀后，放培养箱培养。

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