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小柴不拆
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科研干货|13种蛋白提取方法，赶快收藏手慢无！（三）
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核基质蛋白提取Procotol 1、细胞计数（约1×10^7的细胞），离心（1100rpm×5min）收集细胞； 2、用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mlEP管中，1×PBS洗一遍； 3、加300ulRIPA1×10^7的细胞，裂解细胞，至冰上15-30min， RIPA+PMSF（1:100）+Cocktail（1:1000） 4、4℃预冷离心：13000rpm×10-15min； 5、将离心后的上清转移至新的已4℃预冷的1.5mlEP管中，冰上备用（总蛋白）； 6、用1×PBS洗管底的pellet×2遍； 7、加入Urea-Lysis buffer 10-15ul裂解pellets，vortex10min； 8、4℃遇冷离心：13000rpm×10min；用BUFFER A 90ul稀释，此为核基质蛋白。 植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上； 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）； 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11000rpm20min4℃； 4、提取上清液，样品制备完成； 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCI（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 组织：肠黏膜为例 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇（1.5ml/1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95%乙醇：（2ml/1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心：7500g，5min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2次 沉淀中加入100%乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1%SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1%SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了 白色沉淀，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/1ml左右 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2×BUFFER，然后煮5-10分钟，效果很好的。 |
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