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小柴不拆
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科研干货|13种蛋白提取方法，赶快收藏手慢无！（二）
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Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白 1、细胞计数（约1×10^6的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）； 2、预冷1×PBS500ul重悬洗一次，转至500ulEP管（2000rpm×5min）； 3、 去上清，后甩一次，将上清去尽； 4、按每1×10^6的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading； 5、Vortex一下，煮10~15min一次×2~3次直至无粘丝； 6、每次煮好将其放于冰上，静置约2min，Vortex一下，再甩一下； 7、三次后用枪吸气，没有粘丝后，即可； 8、每次上样约5ul（50ug/ul蛋白） RIPA裂解抽提总蛋白 1、细胞计数（约1×10^7的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）； 2、预冷1×PBS1mll重悬洗2次，转至1.5mlEP管（2000rpm×5min）； 3、 去上清，后甩一次，将上清去尽； 4、按照如下比例加入裂解试剂： RIPA：300ul/1×10^7细胞 PMSF：3ul（1:100） Cocktail：0.3ul（1:1000） 5、吹打均匀、冰上冷置30-40min，中间每10分钟Vortex一下； 6、4℃预冷离心：10000rpm×10min； 7、收集上清，转移至已预冷新EP 管，即为总蛋白。 核浆蛋白抽提 一.收核-浆蛋白 收浆蛋白 1、细胞计数（约1.5×10^7的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）； 2、用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mlEP管中，离心（4000rpm×5min,4℃）； 3、去上清，加入A Buffer1mL/1×10^7cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm×3min,4℃）； 4、去上清，加入A’Buffer 250ul/1.5×10^7cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min,4℃），吸取上清（上清是浆蛋白） 收核蛋白 5、再用A’Buffer 500ul/1.5×10^7cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min,4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净； 6、剩余沉淀中加入B’Buffer（或者RAP）50ul，重悬（振荡），4℃放置40min（每隔10min振荡一次）； 7、离心（12000×10min,4℃），取上清即为核蛋白，-80℃保存。 |
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