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动物实验日常操作：小鼠骨髓间充质细胞元代分离
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BMSCs来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，免疫原性低。但是不同的分离培养方法使得BMSCs在体外扩增时的纯度、活性、表型和分化潜能差异很大，导致基础研究结论各异和临床试验效果不一。因此，深入认识BMSCs不同分离方法和培养条件的优缺点，并根据实验目的做出相应选择，是进行BMSCs实验研究的关键环节。 目前用于分离BMSCs的方法主要有五种，分别是贴壁筛选法、骨组织消化法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和磁珠分选法。 下面向大家详细介绍贴壁筛选法，对初次培养者来说，贴壁法分离BMSCs操作简单易掌握，不易发生污染，是一个较好的分离方法。不足的是分离提取的细胞纯度相对不高。 贴壁筛选法 贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的方法，常用于干细胞的培养中，因此用于分离BMSCs最为广泛。 利用BMSCs贴壁生长特性，更换培养液逐步去除漂浮生长的造血系统细胞即可获得较纯化的BMSCs；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质,可促进BMSCs贴壁生长，贴壁筛选法也常被称为直接培养法或者全骨髓法。 操作步骤： 01 以颈椎脱臼法处死SPF级3-4周龄C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。 02 随后在鼠的腿的位置剪开外皮和内皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于无菌含双抗PBS溶液中。剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织，用含双抗的PBS溶液清洗三遍。 03 用眼科剪剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔。 04 用注射器以完全培养基反复冲洗骨髓腔直至骨头发白。 05 收集骨髓液，离心，后加入适当培养基（含20%血清）接种于培养基皿中置于37℃，5％ CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。 06 24-48h后去悬浮，接下来的每3天换液一次，直到需要传代。 骨组织消化法 骨组织消化法操作简单、成本低，且获得的BMSCs纯度较贴壁筛选法高，是分离BMSCs较为常用的方法。 操作步骤 01 参照贴壁筛选法上述操作步骤第1-3步，收集冲去骨髓的股/胫骨于无菌的培养皿中，用无菌眼科剪小心地将骨组织剪成约1～3mm3的碎片。 02 之后加入适量含1mg/mL Ⅱ型胶原酶的新鲜完全培养基（含5% FBS），于37℃摇床中振荡消化 。 03 消化结束后离心，弃上清液，用PBS清洗两次，然后将骨碎片接种于培养皿中，加入适量新鲜的完全培养基（含20% FBS）淹没骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。 04 培养至72h后进行首次半量换液。此后每3天换一次液。待贴壁细胞达到80%~90%融合，进行细胞扩增传代。 |
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