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一芯向南新虫 (小有名气)
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高纯度RNA的提取方法及操作中的注意事项 已有1人参与
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RNA提取 在分子生物学研究中，多数实验需要获得目的基因的序列进而确定基因的表达水平，这就需要得到样品中高质量、高纯度的RNA，本文就RNA提取的原理、方法和注意事项进行总结，并提供了不同类型样品RNA提取的推荐试剂盒。 RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此RNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 RNA提取方法 最常用的RNA提取方法是Trizol法。Trizol试剂直接从细胞或者组织中提取总RNA，该试剂含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，并保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分水样层和有机层，RNA位于水样层中，收集水样层，通过异丙醇沉淀将其还原，可得到纯净RNA。 RNA提取步骤 细胞或组织裂解 1) 细胞裂解 a) 贴壁细胞裂解。6 孔板培养细胞，弃培养液，预冷的 PBS 洗涤一次，每孔加入 1 mL RNA提取试剂（TRIZOL 型），吹打混匀，转移到 1.5 mL EP 管中，室温静置 5 min。 b) 悬浮细胞裂解。离心收集悬浮细胞，按照 5-10×106 个细胞需要 1 mL RNA 提取试剂（TRIZOL）的比例加入试剂，混匀，室温静置 5 min。 2)组织裂解。称取 10-50 mg 组织（新鲜或-70℃或液氮中保存的均可），置于1.5 mL EP 管中，加入 1 mL RNA 提取试剂（TRIZOL 型），利用手持式电动匀浆仪进行匀浆处理，室温静置 5 min。 加入200 μL 氯仿，剧烈震荡（Vortex）15s。 12,000 ×g，4 ℃，离心 10 min，样品分为三层，RNA 集中在上层的无色水相中，DNA 集中在中间层，而蛋白集中在下层的淡紫红色液相中。 转移上层水相至新的 EP 管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀 10-20 次。 12,000×g，4 ℃离心 10 min，可以在管底或管壁上看到白色凝胶状的 RNA 沉淀，弃上清液。 加入 1 mL 75%的乙醇，轻微震荡 15 sec，洗涤 RNA 沉淀。 12,000×g，4 ℃离心 5 min，RNA 沉淀到管底，弃上清。 瞬时高速离心，使管壁上的液体离心到管底，利用微量移液器吸尽液体，晾干。 加入 100-200 μL RNA 溶解液或 RNase-free ddH2O，溶解 RNA。 测定 RNA 浓度与纯度，用于反转录或其它实验，或保存于-80℃冰箱。 RNA提取注意事项 所有实验所用的枪头、离心管等消耗品均要使用RNase-free的； 整个过程要在无RNase污染的条件下进行，通常可以在无菌操作台中进行实验，并用75%的酒精进行擦拭杀菌； 所有相关溶液的配制要使用RNase-free水或DEPC水 (包括75%酒精也需要用无水乙醇与DEPC水配制)； 溶液的配制使用移液器进行操作，切勿使用量筒等中间器皿； 研钵、研棒、镊子、剪刀等用锡箔纸包好后，200℃干热灭菌4h； 实验过程中一定要戴手套和口罩（可以避免实验过程中不打喷嚏）； 异丙醇、氯仿、乙醇等试剂使用避免多次使用的交叉污染； |
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